透明质酸纳米材料在荧光/光声成像和光疗中的应用

　　摘要荧光/光声成像和光疗技术的生物医学应用引起了人们越来越多的关注，然而很多荧光/光声造影剂存在生物相容性较差，缺乏肿瘤靶向性，信噪比较低，功能单一等共性问题，严重限制其诊疗应用。透明质酸具有优异的生物相容性和主动肿瘤靶向性，可被透明质酸酶降解，并且易于化学修饰和实现多种超分子弱相互作用力协同工作。因此，人们将透明质酸与荧光/光声造影剂结合制备纳米材料，使其在细胞乃至活体的标记性能和治疗效果获得了很大的改善。本文综述了将两类物质结合制备纳米材料的方法，着重阐述了纳米材料的结构与性能关系，为其未来设计和开发提供了指导，最后对存在的主要问题以及未来的重要研究方向进行了分析和展望。

　　关键词透明质酸;荧光成像;光声成像;光热治疗;光动力治疗

　　1引言

　　对恶性肿瘤的早期诊断和有效治疗是提高治愈率和存活率的一个重要手段[1-2]。作为用于恶性肿瘤临床早期诊断和定位的非侵入式新兴影像技术，荧光(FL)成像和光声(PA)成像在生物医学领域的研究和应用引起了人们的高度重视[3-7]。它们不需使用放射性物质，具有实时动态监测、灵敏度高和费用较低等优点，而且有可能在成像的同时进行治疗。

　　其中，双光子、近红外(NIR)一区(750-1000nm)和NIR二区(1000-1700nm)荧光成像的激发波长在生物光学窗口范围内，与可见光区成像相比，生物组织对光的吸收和散射比较少，光致损伤小，自发荧光更弱，信噪比高，穿透能力更强，分辨率和灵敏度大幅度提高，近年来被广泛应用于各种疾病的实验研究，主要集中在肿瘤、炎症和心血管疾病的早期诊断和治疗效果的动态监测[8-13]。

　　光声成像则结合了光学成像的高对比度、高分辨率和超声成像的高穿透性优势，其原理是生物组织在脉冲近红外激光照射下吸收光能将之转为热能，导致体积周期性膨胀，从而通过收集产生的超声信号重构生物组织影像，已经在淋巴结、毛细血管、脑部肿瘤等的成像研究中取得了较好的结果[14-17]。而且，有的荧光造影剂被光激发后能同时产生具有强氧化能力的活性氧(ROS)，可以作为光敏剂(PS)，有的光声造影剂能把吸收的近红外光能转化为局部高热，活性氧和局部高热在病灶部位能够有效杀伤疾病细胞。这两种光疗方法分别被称为光动力治疗(PDT)和光热治疗(PTT)，不仅能进行无创疾病治疗，还可以通过对外加光源进行控制，很好的区分病灶部位和正常组织，有效提高治疗选择性，减少副作用[17-21]。

　　目前，人们已研究开发出多种荧光/光声造影剂，可分为无机材料(例如半导体纳米晶、贵金属Au和Ag纳米粒子、上转换纳米粒子、碳基纳米材料等)和有机材料(例如共轭材料、各种染料小分子等)。将这些造影剂直接进行生物应用时，其性能常存在如下共性问题：①水溶性较差，导致生物相容性低;②缺乏肿瘤靶向性和智能化响应，信噪比较低，对正常组织的毒副作用较大，③功能比较单一，在多模态成像及多种治疗方式相结合提高诊疗效果方面尚需进一步探索。

　　为此，人们将荧光/光声造影剂与透明质酸(Hyaluronicacid,HA)结合，使其性能获得了很大的改善。HA是生物体内的天然成分，由葡糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)的双糖单位重复连接形成的链状聚合物，分子中含有的大量羧基、羟基、酰胺基，使其在水溶液中可形成分子内和分子间氢键，并产生多级结构。

　　因此，HA具有优异的水溶性和生物相容性，可实现多种超分子弱相互作用力(静电作用、氢键作用、疏水作用和空间匹配等)协同工作，其分子中的四个部位——羟基、N-乙酰氨基、羧基以及还原末端，均可被化学修饰[9]。尤为重要的是，在多种肿瘤病变局部(如乳腺癌、肝癌、脑癌、胰腺癌和膀胱癌等)，若干HA特异性受体的表达会明显升高(其中最重要是CD44受体)，因而HA衍生物具有主动肿瘤靶向性，并且能被肿瘤细胞中高浓度的透明质酸酶降解[27]。

　　因此，人们将HA和抗癌药物结合起来，研究开发了大量的靶向给药体系，很好的改善了药物输送和治疗的效果[28]。近年来，人们又将荧光/光声造影剂与HA的优势特性相结合，获得了具有较好生物相容性和肿瘤靶向性的纳米材料，可同时实现荧光、光声成像等多模态成像，以及光热治疗、光动力治疗或化疗的协同治疗功能。本文将主要就HA与荧光/光声造影剂如何结合制备纳米材料，及其在荧光、光声成像和协同治疗等方面的应用做一简要综述。

　　2透明质酸与荧光/光声造影剂结合制备纳米材料的方法

　　2.1化学修饰方法HA的化学修饰主要在以下三个位点进行：

　　①GlcUA上的羧基，通常在水性条件下先用碳二亚胺和N-琥珀酰亚胺(NHS)或1-羟基苯并三唑(HOBt)使其活化得到活性酯，再与伯胺反应成酰胺或与醇反应成酯;②GlcNAc中C-6位上的羟基，用酸酐、酰氯或环氧化物等使其酯化或成醚;③二糖重复单元的还原端，可以对其进行还原胺化来改性[29]。

　　目前，大部分荧光/光声造影剂与HA的化学结合位点在羧基，但由于羧基在与HA受体的特异性相互作用中起重要作用，需要注意控制修饰的程度，研究表明对羧基的少量修饰(小于25%)不影响HA有效识别受体[30]。Luo等[31-32]在HA上通过酰胺键接枝氟化硼二吡咯甲川染料(BODIPY)，Shi等[33]合成了二碘苯乙烯基BODIPY(DBHA)，使其吸收和发射光谱红移，并在HA上通过酯键进行接枝。

　　3基于透明质酸的纳米材料应用于荧光/光声成像及光疗

　　3.1HA与无机造影剂结合

　　无机荧光/光声造影剂通常存在水溶性和生物相容性差的问题，无法直接用于生物体进行成像或治疗;或者粒径过小，如果小于10nm，在体内循环时容易被肾脏快速清除。

　　3.1.1半导体纳米晶体量子点(QD)QD具有宽的激发光谱、窄的发射光谱、可精确调谐的发射波长以及良好的抗光漂白性能等优越特性。Bhang等[34]将用静电吸附法制备的HA-QD纳米粒子对过量表达HA受体的HeLa(宫颈癌)细胞进行荧光成像，证明其具有较好的靶向性和较小的细胞毒性。对裸鼠的耳朵皮下注射HA-QD进行淋巴管系统成像，发现沿着血管内壁具有明亮荧光的淋巴管清晰可见，证明其可与淋巴管内皮受体1(LYVE-1)等作用进入淋巴管内细胞，具有数天的长时间成像能力，有希望用于实时显示淋巴管生成，而未连接HA的QD成像结果则很模糊。

　　3.1.2Au、Ag纳米粒子(NP)Au、AgNP具有独特的光学性质，包括表面增强，距离/折射率依赖的光谱性质和抗光漂白性能，在近红外区域有强烈的吸收和有效的光热转换。Wu等[41]开发了一类具有核壳结构的Ag-Au@PEG-HA杂化多功能纳米凝胶。它以Ag-Au双金属NP为核，以热响应非线性PEG基凝胶为壳，能响应温度变化产生可逆膨胀和收缩，从而影响Ag-AuNP核的物理化学环境实现荧光传感，同时控制抗癌药物替莫唑胺的释放;凝胶表面通过氢键再覆上HA，用于靶向小鼠黑色素瘤B16F10细胞过量表达的CD44受体，提高成像效果。

　　这样，Ag-Au@PEG-HA将环境响应的荧光传感、靶向癌细胞的荧光成像、光热治疗、可控药物释放等功能结合到一个体系中。Lee等设计了一系列纳米Au与HA复合的荧光探针[42-44]。例如，将荧光素标记的HA在还原末端修饰上多巴胺后，通过多巴胺与Au形成比Au-S键更加稳定的Au-儿茶酚键，并且由于纳米粒子HFAuNPs表面能量转移使荧光素猝灭;而活性氧(ROS)，如超氧阴离子()和羟基自由基()，能降解HA，使荧光素的绿色荧光恢复，从而能实时定量检测ROS。与常用市售2’,7’-二氯二氢荧光素(DCFH)等ROS探针相比，该探针监测细胞内ROS的性能更优异[42]，可以作为ROS的细胞成像探针。

　　3.2HA与有机造影剂结合

　　与无机材料相比，有机荧光/光声造影剂易于通过结构设计调控光谱范围，进行功能化修饰，生物毒性较低;但是水溶性仍需要改善，小分子在体内循环时间短，易被化学分解。

　　3.2.1共轭材料

　　共轭材料包括共轭小分子和聚合物，具有摩尔吸收系数大、荧光量子产率高、光稳定性好和生物毒性较低的优点[24,56]。人们将HA与共轭小分子[57-59]、共轭聚合物[39-40,60]等结合制备了一系列的纳米材料。Huang等[40]在HA上共价连接阿霉素(DOX)，HA-DOX与阳离子型共轭聚合物PFEP通过静电作用形成纳米粒子，同时PFEP的荧光被DOX猝灭。当纳米粒子进入HeLa细胞后，HA被透明质酸酶(HAase)降解，因此PFEP荧光被激活，并由此实现对HAase的定量荧光检测，以及靶向荧光成像和药物控制释放。

　　4总结与展望

　　HA具有优异的水溶性、生物相容性，能与多种恶性肿瘤表达的受体特异性结合，可被透明质酸酶降解，并且易于化学修饰，可实现多种超分子弱相互作用力协同工作。人们利用这些优势特性，能够通过简便的方法将HA与各种无机、有机荧光/光声造影剂结合制备纳米材料，提高造影剂的生物相容性，改善化学稳定性和光稳定性，延长在体内循环时间从而增强渗透与保留效应，并能实现对乳腺癌、宫颈癌、肝癌、脑癌、胰腺癌、结肠癌和膀胱癌等肿瘤的主动靶向。

　　另外，利用透明质酸酶对HA的降解实现智能化可激发响应，进一步提高灵敏度和信噪比;而且，还易于同时负载其它类型造影剂或抗癌药物制备复合纳米材料，从而实现FL、PA、NMR、CT或PET成像等多模态靶向成像，以及光热治疗、光动力治疗或化疗的协同治疗功能，显著提高了细胞乃至活体标记效能和诊疗效率，减小治疗的副作用。因此，该类纳米材料具有很好的潜在临床应用前景。

　　迄今为止，该领域基本还处在实验室研究阶段，仍然存在很大研究空间。新型荧光/光声造影剂的研究开发方兴未艾，灵敏度、穿透性和安全性等性能更好的NIR-II荧光造影剂和光声造影剂有待进一步开发;为了减少背景噪音、浓度干扰，准确反映影像信号和疾病状态的实时关系，将造影剂分子设计与HA结合，研制对肿瘤温度、pH值、还原性物质、活性氧、酶等产生多重可激发智能响应的HA衍生物及其纳米材料，将成为今后的重要发展方向。

　　纳米材料论文：浅谈医学纳米材料的应用与发展

　　然而，该类纳米材料要实现临床转化，也面临着很多亟待解决的问题和挑战。体内研究还处于起步阶段，需要进一步探索其与其它生物的系统相互作用，深入研究纳米材料的结构、形貌、尺寸等对细胞摄取、造影能力和治疗效果的影响，提高体内诊疗效率;对其在生物体内的分布、生物毒性、体内的降解及排除机理需要进行更系统的评估，获得长期生物安全、免疫反应和药物代谢动力学等更全面的体内研究结果,为临床实际应用提供重要支撑。相信通过化学、材料、生物和医学多学科领域科研工作者的合作和努力，这类材料可望在临床诊断和疾病治疗上产生重要的应用价值。

　　作者：潘立祥黄艳琴*,盛况张瑞,c范曲立黄维