铁泵蛋白Ferroportin生理功能及其调控机制研究进展

　　摘　要 ：铁泵蛋白 (ferroportin, FPN/SLC40A1) 是目前哺乳动物中唯一已知的铁外排膜蛋白，在调控机体铁稳态代谢过程中发挥重要作用。近年，围绕 FPN 蛋白转运铁离子生理功能及其分子调控机制方面取得了令人瞩目的研究进展。FPN 蛋白通过从细胞内向外转运 Fe2+ 参与许多关键生理过程，如细胞代谢、细胞命运以及铁死亡 (ferroptosis) 等。铁调素 (Hepcidin) 作为肝脏分泌的多肽，通过与 FPN 蛋白结合导致 FPN 内化降解，从而抑制小肠铁吸收及巨噬细胞的铁再循环，因此，Hepcidin-FPN 轴是机体系统性铁稳态调控的核心枢纽。然而，FPN 的具体降解机制一直是铁代谢领域内的热点及难点。近期，本研究团队发现 E3 泛素连接酶 RNF217 介导 FPN 降解及其受 TET1 ( 甲基胞嘧啶双加氧酶 1) 修饰调控铁稳态代谢的新机制。临床研究发现，携带 FPN 基因突变的个体出现不同临床表现的血色病。此外，有研究报道 FPN 在肝脏疾病、肠道疾病、心脏疾病、贫血及癌症中发挥重要作用，提示 FPN 或可成为防治这些疾病的关键靶点。本文系统综述了 FPN 在金属离子转运、疾病发生及分子调控机制等方面的国内外最新研究进展，并就未来研究方向进行了展望和讨论。

　　关键词 ：铁 ;铁泵蛋白 ;铁调素 ;离子转运 ;血色病

　　铁作为生命体必需微量元素，不仅是合成血红蛋白的原料，更是许多氧化还原酶类的辅助因子，对于氧气运输、线粒体呼吸及 DNA 合成等具有重要意义 [1]。因此，铁在机体维持生命健康中扮演重要角色。机体内铁稳态受到精密调控，铁缺乏或铁过载都会影响人类健康。机体铁缺乏时多表现为头晕、烦躁、易怒及免疫力减弱，甚至引起缺铁性贫血 [2-3] ;而机体铁过载时会产生过量的自由基，破坏蛋白质、核酸和细胞膜功能，引起细胞毒性，严重时可引起遗传性血色病 [4-5]。

　　细胞内铁过载时亦可引发铁死亡 (ferroptosis) ;铁死亡是基于脂质的活性氧积累引起的一种铁依赖性细胞死亡形式，其发生机制、形态学特征、生化特征及分子标志物均不同于细胞自噬、凋亡和坏死 [6] ;铁死亡在心血管疾病、肝脏疾病及神经退行性疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD) 和脑出血等的发生发展中起重要作用 [7-10]。由此可见，维持机体内铁稳态对于机体健康的保持是非常有必要的。铁泵蛋白(ferroportin, FPN)，作为目前哺乳动物中唯一已知的铁外排膜蛋白，通过将细胞内的 Fe2+ 转运至细胞外而维持细胞内的铁水平，其表达高低直接关系到细胞内外的铁水平 [11]。

　　因此，FPN 在维持机体和细胞铁稳态中发挥关键作用。已有研究揭示 FPN 介导的铁稳态失衡参与了肠道、骨骼、大脑及肝脏等组织器官相关疾病的发生发展，深入探究 FPN 的生理功能及相关的分子机制可为诊治此类疾病提供重要理论依据。FPN 蛋白，由基因 FPN 编码，又被称为铁调节转运蛋白 1 (iron-regulated transporter 1, IREG1) 或金属转运蛋白 1 (metal transporter protein 1, MTP1)。哈佛医学院 Leonard I. Zon 团队 [12] 最早于 2000 年用斑马鱼模型发现该基因并命名为 Ferroportin(FPN)，其在调节细胞和机体铁水平中起关键作用 [13-14]。从 FPN 被发现并命名到 2021 年其人源结构被解析，关于 FPN 有了一系列里程碑式科学发现 [7, 11-12, 15-38]。FPN 的表达具有组织特异性，主要表达在十二指肠上皮细胞、肝脏 Kupffer 细胞、脾脏红髓巨噬细胞、门静脉周围肝细胞以及胎盘合体滋养层细胞 [39]。

　　铁调素 (Hepcidin) 是一种含有 25 个氨基酸的肽，主要由肝细胞分泌到血浆中，它可与细胞膜上的 FPN 蛋白结合，导致 FPN 内化降解，从而抑制巨噬细胞铁释放和十二指肠铁吸收，平衡机体铁稳态 [20, 39]。有研究证实肠道树突状细胞也可分泌Hepcidin，在调节微生物平衡和促进肠道修复中起重要作用[40]。Hepcidin与FPN结合触发其构象变化，使 FPN 的赖氨酸可通过 E3 泛素连接酶环指蛋白 217 (RING finger protein 217, RNF217) 进行泛素化 ;在铁存在的情况下，铁依赖性双加氧酶 (irondependent dioxygenase) Tet1 通过去甲基化激活基因RNF217 的转录并升高其细胞内浓度，从而促进FPN 的内吞作用和蛋白质水解 [38]。

　　因此，低 Hepcidin状态的特征是铁转运活跃组织中 FPN 蛋白表达水平高，铁迅速外排到细胞外液和血浆中。与此相反，循环中高浓度 Hepcidin 导致 FPN 从细胞膜上降解，铁向血浆的外排减少。Hepcidin-FPN 调节轴是整个铁稳态的核心 [30]。该轴受到转录因子、炎症、缺氧、贫血及铁含量等多种机制的调节。FPN 在体内铁外排中的关键作用是通过一系列转基因小鼠确定的。FPN 全身敲除小鼠并没有完成胚胎发育 ;肠细胞特异性敲除 FPN 的成年小鼠也迅速变得贫血，表明FPN对于肠吸收铁是必需的[20]。进一步使巨噬细胞和肝细胞中的 FPN 失活的工作表明，这些细胞需要 FPN 来有效动员储存的铁 [27, 29]。FPN可转运Fe2+已被证实。但是也有研究表明，FPN 还可能转运 Mn2+，进一步丰富了 FPN 的转运调控网络 [41-44]。本文旨在对 FPN 调控金属离子转运的生理功能、分子机制及其对代谢紊乱疾病的调控等进行系统综述。

　　1 FPN的发现及研究进展

　　机体对铁的吸收是通过十二指肠黏膜刷状缘来实现的，但是铁如何通过基底外侧膜转移到血液中机制未知，针对这一关键科学问题的探索导致了 FPN 蛋白的发现 。首先发现 FPN 的两篇重要论文发表于 2000 年几乎同一时间。Robert J.Simpson ( 英国 )、 Matthias W. Hentze ( 德国 ) 和 MatthiasA. Hediger ( 英国 ) 三个实验室联合 [15]，利用非洲爪蟾 (Xenopus laevis) 卵母细胞进行研究发现了在肠上皮细胞基底膜上具有外排铁离子功能的蛋白并将其命名为 Ireg1，该成果于 2000 年 1 月 25 日发表在 Molecular Cell 杂志，其投稿时间为 1999 年 10 月26 日。Zon 团队 [12] 使用定位克隆技术鉴定出导致斑马鱼突变体低色素性贫血的基因并将其命名为ferroportin，详细展示了 FPN 蛋白外排细胞铁的重要功能。

　　Zon 团队成果于 2000 年 2 月 17 日以 Article形式正式发表在 Nature 杂志，该论文投稿时间为1999 年 12 月 16 日。从 2001 年至 2003 年，研究相继发现基因 FPN 突变可导致常染色体显性遗传性血色病 [16]，膜蛋白 FPN 的表达与肝脏 Hepcidin 的分泌成负相关 [17]，基因 FPN mRNA 中存在铁反应元件 (iron response element, IRE) 可影响基因的表达 [18]，丰富了 FPN 的调控网络。2004 年，Nemeth等 [19] 首次报道 Hepcidin 可与 FPN 结合诱导其内化来控制细胞内铁外排，提示 FPN 功能的实现受到Hepcidin 的调节。2005 年，陆续有研究报道 FPN对铁稳态的维持至关重要 [20]，其突变可引起两种不同发病机制的血色病 [21]，巨噬细胞膜上 FPN 的表达直接受到铁负荷和 Hepcidin 的影响 [22]，进一步加深了人们对 FPN 的认识。从 2007 年到 2011 年，王福俤课题组发现 Mon1a 基因变异会影响 FPN 蛋白转运并改变小鼠的巨噬细胞铁负荷 [24]，而且 FPN在巨噬细胞释放铁的过程中起重要作用 [27]，提示巨噬细胞的铁水平很大程度上取决于 FPN 的功能发挥。

　　其中，Zhang 等 [45] 于 2009 年发现了另一种剪接变体 FPN 1B，其 mRNA 不含 IRE 并且在缺铁时翻译不受抑制，揭示了 FPN 的又一重要功能。2012 年，Qiao 等 [28] 发现 Hepcidin 诱导的 FPN内吞作用依赖于 FPN 泛素化，但是相关的 E3 泛素连接酶一直未确定 ;直到 2021 年，王福俤团队 [46]首次报道 RNF217 通过其 E3 泛素连接酶活性来介导 FPN 降解从而调节铁稳态，表明 Tet1-RNF217-FPN 轴调节铁稳态，揭示了 FPN 相关疾病的治疗新靶点，此项工作得到了同行专家的高度评价 [47-48];2012 年，王福俤团队 [29] 还利用组织特异敲除 FPN小鼠研究发现，体内铁储备的动员需要肝细胞和巨噬细胞中 FPN 的参与，证实了 FPN 在铁循环中的关键角色。

　　从 2014 年至 2019 年，有研究报道 FPN C326S突变可抵抗 Hepcidin 降解并造成严重的铁过载 [30]，Sabelli 等 [31] 的研究揭示了人类巨噬细胞 FPN 的生物学基础以及引起 FPN 相关血色病的原因，而Aschemeyer 等 [32] 通过 FPN 的结构 - 功能分析解释了 Hepcidin 的结合位点和作用机制，从结构上分析了有关原因 ;Zhang 等 [11, 33] 发现红细胞 FPN 可降低细胞内铁积累、溶血和患疟疾风险 ，其缺失可使红细胞因氧化应激而导致溶血 ;Muriuki 等 [34] 报道FPN Q248H 突变可预防贫血，但不能预防疟疾或菌血症 ;口服 FPN 抑制剂 VIT-2763 可改善 β- 地中海贫血中的无效红细胞生成 [35]。以上研究提示，FPN对于红细胞发挥正常功能起关键作用。

　　2020 年，Billesbølle 团队 [36] 利用冷冻电镜解析了人源 FPN的结构，揭示了 FPN 与 Hepcidin 互作的结构基础，解释了铁稳态平衡的原因，成果发表在 Nature，为深入探索 FPN 的功能提供了重要的参考依据。仅数周后 Pan 等 [37] 在 Nature Communications 发表菲律宾眼镜猴 FPN 蛋白结构成果。Bao 等 [8] 报道靶向 miR-124/FPN 信号可抑制细胞凋亡和铁死亡从而改善神经元状况。2021 年，Bao 等 [7] 报道 FPN 的缺失通过促进 AD 中的铁死亡来诱导记忆障碍，提示 FPN 在铁死亡的发生中起重要作用。FPN 是否还有其他功能，有待进一步探索。

　　2 FPN的拓扑结构及金属离子转运功能

　　2.1 FPN的拓扑结构人源

　　FPN 蛋白含有 571 个氨基酸和 12 个跨膜结构域 ( 图 2)[49]。FPN 是一种多跨膜蛋白，之前关于其拓扑结构和功能状态存在争议。有研究表明，FPN 蛋白的 C 端和 N 端都在细胞内，其二聚化发生在细胞内 [50]。之前通过使用表位标记的 FPN 的免疫共沉淀研究发现 FPN 是多聚体 [51]。De Domenico等 [23] 通过蛋白质印迹分析发现，内源性 FPN 是一种二聚体。Aschemeyer 等 [32] 的计算模型研究显示，Hepcidin 与 FPN 的结合发生在 FPN 的中央腔内并且 Hepcidin 与多达 4 个螺旋相互作用，FPN 的突变会降低与 Hepcidin 的结合力，也会阻碍 FPN 的泛素化和内吞作用所需的构象变化。Pan 等 [37] 的研究展示了菲律宾眼镜猴 FPN (ferroportin from Philippinetarsier, tsFPN) 的结构，其由两个结构域组成，每个域各含一个金属离子结合位点。其次，tsFPN 是一种电中性的 H+/Fe2+ 反向转运蛋白，每个 Fe2+ 与两个 H+ 以相反的方向被转运。

　　直到 2020 年 3 月，Billesbølle 等 [36] 利用冷冻电镜才揭开人源 FPN 结构的面纱。研究表明，FPN 包含十二个跨膜结构域排列的螺旋，其 N 端和 C 端结构域都由六个螺旋组成，有一个大的中心空腔，该空腔向细胞外开放，在细胞内封闭，Hepcidin 通过引起细胞内环3 (intracellular loop 3, ICL3) 中赖氨酸残基的泛素化来调节 FPN ;其中，K240 对 Hepcidin 诱导的 FPN内化和降解至关重要。Hepcidin 通过与位于第七跨膜结构域 (seven-span transmembrane, TM7) 内的关键残基进行重要的相互作用来结合 FPN 的向外开放构象，TM7b 中的 C326S 突变可导致铁超载。这些发现详细解释了 FPN 介导铁转运和 Hepcidin 调节的分子机制，对进一步了解铁稳态具有重要意义。FPN 与 Hepcidin 结合后，就会被酪氨酸磷酸化，然后内化、去磷酸化并随后泛素化，泛素化的 FPN通过多泡体途径运输到晚期内体 / 溶酶体中进行降解 [52]。

　　3 FPN蛋白调节机制

　　3.1 FPN基因表达调控

　　3.1.1 FPN基因转录水平调控

　　FPN 在转录、转录后和翻译后水平上受到调控 [139]。FPN 可以通过铁及其他过渡金属进行转录调节，也可以通过铁调素介导的内化和降解进行翻译后调节。研究表明，锌和镉通过金属转录因子 -1(metal transcription factor-1, MTF-1) 的作用诱导FPN转录 [13]。IRE 是约 35 个核苷酸 (nucleotide, nt) 的茎环 RNA 结构，位于 mRNA 的 5' 或 3' 非翻译区(untranslated region, UTR)，通过与铁调节蛋白 (ironregulatory protein, IRP)相互作用介导转录后调控[140]。FPN mRNA 5' UTR包含一个IRE[141]。

　　在缺铁条件下，它与 IRP 蛋白结合，抑制翻译 [18]。因此，铁在翻译水平上增强 FPN 的表达。FPN 3' UTR 可被细胞缺铁诱导的 miR-485-3p 靶向调控 [142]。随着细胞铁水平的升高，这种 miRNA 的下调也可能导致 FPN 表达的增加。多诺瓦利什曼原虫 (Leishmania donova)通过诱导 IRP 与 FPN 5' UTR 中存在的 IRE 结合来抑制 FPN 翻译，从而增加巨噬细胞内用于繁殖的铁含量 [143]。FPN 在其启动子序列转录起始位点上游含有一个 7 kb 的抗氧化反应元件 (antioxidantresponse element, ARE)[144]，该元件可以与 Bach1 或Nrf2 结合，导致转录抑制或激活。血红素可引起Bach1 降解，导致 FPN 转录激活 [39]。然而，研究证实十二指肠上皮细胞和前体红细胞可表达另一种剪接变体 FPN1B mRNA，其编码相同的 FPN 蛋白。但 FPN1B mRNA 的 5' UTR 中不含 IRE，所以在缺铁的情况下，其翻译不受 IRP 的抑制。

　　肠上皮细胞中的铁耗竭时，肠道缺氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor, HIF)-2α mRNA 的翻译不被抑制，FPN 蛋白和 mRNA 表达反而增加，说明 IRE/IRP 系统未发挥作用，这很大可能是因为 FPN 1B 的存在。低铁情况下，前体红细胞中 FPN1B 的表达上调可促进铁外排，有助于机体铁稳态的恢复 [39, 45]。研究表明，HIF-2α 对于全身性铁缺乏和铁过载的局部吸收反应至关重要。肝脏的 Hepcidin 在铁缺乏、贫血和铁过载时可调节肠道 HIF-2α，其配体FPN 通过调节铁依赖性肠道脯氨酰羟化酶的活性来控制细胞自主铁流出以稳定和激活 HIF-2α[145]。野生型小鼠喂食低铁饲料 2 周后，FPN 在十二指肠的表达反而增加，此过程需要 HIF-2α 的参与，其原因是 HIF-2α 与十二指肠上皮细胞 FPN1B 启动子区域中的 HIF 响应元件 (HIF response element, HRE)结合，从而启动 FPN 的转录。

　　因此，靶向抑制HIF-2α 可减少低铁饮食小鼠的 FPN 表达，表明FPN 在全身铁水平变化后的转录调控机制。即便是HIF-1α 存在的情况下，缺乏 HIF-2α 的小鼠在缺铁时也不能上调十二指肠 FPN mRNA[146]。因此，缺氧和缺铁时，HIF-2α在上调FPN转录中起主导作用。肠细胞中 HIF 的激活会导致顶膜 DMT1 和 DcytB的上调，基底外侧 FPN 也会上调 [146-147]。利用动物模型进行研究发现，缺氧信号可刺激 EPO 生成，通过稳定十二指肠 FPN 加强铁吸收 [148]。此外，在实验诱导小鼠急性贫血期间，FPN 在转录水平受到调节。FPN mRNA 水平在十二指肠和脾脏巨噬细胞中增加，在前体红细胞中显著下调，HIF-1α 和HIF-2α 在细胞和组织中的表达差异可解释 FPN 调节的特异性 [149]。小鼠中铜的缺乏不仅可导致贫血，还上调 HIF-2α，进而影响到 FPN 的表达，改变铁稳态 [150]。

　　4 FPN与铁死亡

　　铁死亡是一种新型的细胞死亡方式，其特征是铁依赖性的脂质氢过氧化物积累而引发的细胞死亡 [199]。铁死亡参与了心血管疾病、肝脏疾病及神经退行性疾病等多种疾病的发生发展 [7-10, 200-206]。而FPN 作为铁的转运体，可参与铁死亡的发生 [207-211]。FPN 通过降低细胞内铁浓度进而负调节铁死亡，其敲降可加速药物如依拉斯汀、西拉美新、拉帕替尼等诱导的细胞死亡，而过表达 FPN 或使用铁死亡抑制剂如 Fer-1、Lip-1 等均可显著减少细胞死亡和ROS 的产生，提示 FPN 可作为调控铁死亡的一个重要靶点 [207-209, 212]。

　　研究发现，脑出血和 AD 的发生与铁死亡有密切关系，FPN 缺失显著恶化了疾病的症状，而使用铁死亡抑制剂或过表达 FPN 同样可有效改善疾病症状 [7-8]。睾丸缺血再灌注损伤引起的生殖细胞和支持细胞死亡、早期脑损伤、氧化应激诱导的髓核细胞死亡、1 型糖尿病引起的认知功能障碍以及年龄相关性白内障的发生，都有铁死亡的参与，是相应细胞的 FPN 表达降低而 ROS 大量产生所致 [210, 211, 213-215]。因此，对于铁死亡而言，FPN 的重要性不言而喻。

　　另有研究表明，在大鼠先兆子痫模型中，miR-30b-5p 通过下调 FPN 增加不稳定 Fe2+ ，进而诱发铁死亡 [216]。多种药物如白消安、叶酸、阿特拉津、棕榈酸等均可通过调控 FPN 的表达来影响疾病的发生发展 [217-222]。高铁饮食亦是如此 [223]。也有研究报道某些基因或蛋白如基因Nrf2、抗衰老蛋白 Klotho、核蛋白 FANCD2 可调控FPN 表达影响疾病的进程 [224-226]。FPN 作为自噬消除的新底物，其降解可促进异种移植肿瘤小鼠模型中的铁死亡 [227]。靶向 FPN 诱导铁死亡杀死肿瘤细胞是某些癌症治疗的新策略 [228-233]。5 FPN与疾病FPN 与许多疾病的发生发展都有联系 ( 图 5)。FPN 突变可导致 4 型血色病。此外，FPN 还参与了许多癌症以及组织器官疾病的发生，突显了 FPN的重要作用。

　　6 总结与展望

　　FPN 作为哺乳动物唯一的铁外排蛋白，主要功能是将细胞内的 Fe2+ 外排进入血液中，以供其他组织器官利用。然而，关于 FPN 的表达差异是否会对体内铁转载的量产生影响，有待进一步探索。作为整个铁稳态的核心，Hepcidin-FPN 轴受到多因素的调控，比如缺氧、贫血、缺铁以及炎症等。对FPN 的众多研究数据给人们提供了一定的理论参考，研发相应的药物具有广阔的应用前景，后续研究可靶向 Hepcidin-FPN 轴开发药物来治疗铁失衡引起的多种疾病。

　　RNF217 是介导 FPN 泛素化降解最重要的 E3 泛素连接酶。是否还有调控 FPN 蛋白降解的其他 E3 泛素连接酶尚未可知，这也是今后研究工作的一个重点。FPN 在全身的组织细胞中几乎都有表达，以十二指肠细胞和巨噬细胞为最多，在骨组织、心脏、肝脏、肠道、大脑等中发挥重要作用，其不同位点的突变可能会导致不同的疾病模型。目前，通过调控 FPN 表达引发铁死亡的报道还比较少，主要集中于中枢神经系统，其他系统中是否也存在类似的现象有待进一步探究，应鼓励利用已建立的多种FPN 基因敲除小鼠模型开展功能及机制探索。

　　FPN 在人类疾病，如肝脏疾病、肠道疾病、心脏疾病、贫血及癌症等中的功能，仍需积极探索。已发表的数据提示，FPN 可能是防治这些疾病的重要靶点。对 FPN 开展深入研究，既能极大地丰富人们对金属元素代谢、SLC 家族膜蛋白功能的理解，又能为疾病防控提供重要的理论依据和新策略。FPN 组织特异性敲除小鼠模型是研究各组织疾病中 FPN 功能的重要工具，应鼓励开发出更多的基因敲除小鼠模型来探索 FPN 可能具有的其他功能，进一步丰富 FPN 的调控网络，这对于更深层次地认识微量元素铁的作用具有重要意义。

　　[参　考　文　献]

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　　作者：李大航1,2#，徐　杉1#，蒋　丽1#，苏韵星1，闵军霞2*，王福俤1*