半夏酚酸类化感物质积累规律研究

　　摘要：通过测定半夏根际土壤及植株不同生长时间不同部位的酚酸类化感物质，明确半夏酚酸类化感物质积累的规律，为进一步探明半夏化感自毒作用导致连作障碍提供理论依据。间隔对半夏块茎皮、块茎去皮、叶、须根和根际土壤进行取样，共取样次，通过HPLC方法检测与化感现象密切相关的种酚酸对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛、对香豆酸和阿魏酸。半夏植株不同部位及根际土均含与连作土壤相同的种酚酸类成分，含量均在6090时达到最高。半夏须根总酚酸的积累量显著性高于其他部位<0.05。其中须根又以对香豆酸含量最高;根际土同样以对香豆酸含量最高。半夏倒苗期左右是连作半夏自毒作用发生的关键时期，此时期的半夏须根酚酸含量最高，其中对香豆酸又占主要地位，高浓度对香豆酸抑制半夏幼苗生长，推测其是主要的酚酸类化感自毒物质。

　　关键词：酚酸;半夏;连作障碍;化感作用;积累;植株

　　半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.作为流通广泛的大宗药材，近年来需求量不断增加，但野生的半夏资源不断衰减，使得栽培半夏所占的比重越来越大。连作障碍continuouscroppingobstacles;replantproblems;replantdisease，即在同一块土壤中连续栽培同种或同科作物时，即使在正常的栽培管理状况下，也会出现生长势变弱、产量降低、品质下降和病虫害严重的现象，连作障碍在早期研究中被称为“土壤病”。

　　连作障碍是药用植物栽培中的一种常见现象，尤以根或根茎入药的药材生产中表现最为突出，如半夏、人参、地黄、三七和丹参等[1−4]都存在着严重的连作障碍问题，表现为轻则减产，重则绝收。引起作物连作障碍的主要因素可以归纳为化感自毒作用、土壤微生态发生改变，土传病虫害严重、土壤理化性质改变等[5−8]，其中化感自毒作用是目前连作障碍研究热点之一。李培栋等[9]分析花生ArachishypogaeaLinn.连作土壤中酚酸类化感物质，发现土壤中对羟基苯甲酸、香草酸、香豆素和苯甲酸会抑制花生幼苗生长并提高花生的发病率。

　　杜家方等[10]在研究连作地黄RehmanniaglutinosaLibosch.根际土壤中酚酸类物质的动态变化过程中发现阿魏酸、香豆酸、丁香酸和对羟基苯甲酸酚酸类物质会抑制地黄块根生长，引发连作效应。课题组前期研究发现半夏连作土壤中含有对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛、对香豆酸和阿魏酸，这种酚酸均是文献中经常报道的酚酸类化感物质，且对半夏的生长发育具有较强的化感作用[10−11]，故推测半夏的连作障碍现象也与以上酚酸类物质所引起的化感自毒作用有关。

　　目前，对半夏酚酸类化感物质的积累和分泌少有研究，半夏的酚酸类化感物质在不同时期的分泌和积累的研究更是缺乏。实验针对连作土壤中已分离鉴定的种酚酸类化感物质，对不同生长时期的半夏植株、根际土壤中的酚酸类成分进行分析研究，探究半夏植株中种酚酸类成分的积累规律，为缓解半夏化感自毒作用和消减连作障碍、为提高其产量和质量提供理论依据。

　　1材料与方法(Materialsandethods)

　　1.1材料半夏种茎来源于四川省南充市龙门镇的野生种茎，直径1.5~2.0cm。经成都中医药大学的李敏教授鉴定，为天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的块茎。方形花盆、河沙、珍珠岩、蛭石和配方全营养液购于广东天禾农资股份有限公司。

　　1.2试剂与仪器

　　1.2.1试剂98%对羟基苯甲酸

　　批号：wkq17060502、99%丁香酸批号：wkq17112307、98%香草酸批号：wkq17112206、98%香草醛批号：wkq17052406、99%对香豆酸批号：wkq17081114和98%阿魏酸批号：wkq17112004均购自成都维克奇生物科技有限公司，上述各对照品质量分数均≥98%。水为蒸馏水，乙腈和磷酸为色谱纯，浓盐酸、氢氧化钠、乙酸乙酯和甲醇等均为分析纯，均购自成都市科隆化学品有限公司。

　　1.2.2仪器

　　WATERSE2695高效液相色谱仪沃特世科技上海有限公司，InertsilODS3C184.6mm×250mmμm色谱柱岛津公司;Allegra64RCentrifuge型冷冻离心机BeckmanCoulter;DUG9070B智能型电热恒温鼓风干燥箱上海琅玕实验设备有限公司;SQP万分之一天平赛多利科学仪器北京有限公司;PHS3E型剂雷磁上海仪电科学仪器股份有限公司;KQ500DE超声波清洗器江苏省昆山市超声仪器有限公司;SHBⅢS循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司;HYBⅡ回旋振荡器江苏金怡仪器科技有限公司。

　　1.3方法

　　1.3.1实验设计

　　取半夏种茎，用蒸馏水反复冲洗，除去泥沙杂质。浸泡，消毒，取出沥干备用。将半夏整齐放置于铺有洁净石英砂的育苗盘中，置于温度为20~23℃的生化培养箱中催苗。待半夏发芽后，取生长情况一致的半夏移栽至含河沙、珍珠岩和蛭石的混合配方基质中，置于20~25℃玻璃人工气候室中培养，期间每隔浇一次0.075%的全营养液以保证半夏植株正常生长。

　　半夏出苗后15开始取样，之后每隔半个月对半夏植株进行取样，每个育苗盘每次取株，共取次。将半夏植株分为须根、块茎去皮、块茎皮和叶个部分，50℃烘干备用;收集半夏根际土壤半夏植株取出后小心抖掉粗沙，用软毛刷刷下附着在须根上面的少量沙子，除去残根等杂质自然风干备用。取半夏种茎，用清水反复冲洗，除去泥沙杂质。浸泡，取出沥干备用。

　　称取300经消毒的洁净石英砂置于发芽盒中，移取、.0016、0162、0812、0.1624和0.6496mg·L−的对香豆酸胁迫液各50，加入石英砂中并充分拌匀，同时设置空白对照，每个处理设置组平行实验。处理后石英砂中酚酸含量分别为0.00、0.27、2.73、13.67、27.33和109.33μ−。取36颗已消毒的半夏种茎种整齐植入处理好的发芽盒中。将布置好的发芽盒放入20±)℃的恒温生化培养箱中，避光培养。

　　色谱条件参考吴立洁等12建立的测定种酚酸的方法，并进行优化。WATERSE2695高效液相色谱仪，InertsilOD184.6mm×250mmμm色谱柱，以乙腈0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，洗脱条件如表所示;流速为∙min−，进样量10μ;检测波长为275nm;柱温为25℃。

　　半夏酚酸含量测定供试品溶液的制备：根际土壤制备方法参考吴立洁等[12]的方法，并进行优化。称取土样过号筛100，置于500锥形瓶中，加入mo∙−NaOH溶液10，振摇，静置18，离心，取上清液，用浓盐酸调节pH至2.5左右，000r∙min−离心min，取上清20，加乙酸乙酯40萃取次。

　　合并乙酸乙酯层，减压浓缩干燥。准确吸取甲醇溶解残渣，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。半夏植株各部位半夏酚酸提取参考饶国栋和张建国[13]的方法，并进行优化。称取样品粉末过号筛，置150锥形瓶中，加mol∙−NaOH50，振摇，静置18，离心，取上清液，用浓盐酸调节pH至.5，000∙min−离心min，取上清10，用乙酸乙酯萃取次，每次20，合并萃取液，减压干燥。准确吸取甲醇溶解残渣，0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得。对照品溶液的制备：分别精密称取对羟基苯甲酸、香草醛、香草酸、对香豆酸、丁香酸和阿魏酸对照品，置于10容量瓶中，以甲醇制成每含羟基苯甲酸100μ、香草醛100μ、香草酸100μ、对香豆酸100μ、丁香酸00μ和阿魏酸100μ混合对照品溶液。

　　1.3.4发芽指标测定

　　待半夏种茎开始发芽时，每天记录半夏种茎的发芽数，共记录14。待实验结束，用刻度尺测定各处理半夏植株的根长。

　　1.3.5评价方法

　　发芽率萌发终期正常发芽种子数/供试种子数×100%;发芽势萌发高峰期正常发芽种子数/供试种子数×100%，萌发高峰期指发芽过程中日发芽种子数达到最高峰的时期;发芽指数=∑，式中：为在时的种子发芽数，为相对应的发芽时间d);化感效应指数esponseindexRI采用BruceWiliamson和Richardso[14]的方法：RI=1−当≥时或RI−当<时，式中：RI为化感效应指数，为对照值指标，为处理值指标。当RI时，表示促进作用，当RI时，表示抑制作用，RI绝对值代表化感作用强度。

　　2结果(Results)

　　吸取供试品溶液、对照品溶液各10μL注入高效液相色谱仪，对半夏根际土及半夏各部位所含酚酸进行定性和定量分析。从半夏植株的须根、块茎去皮、块茎皮和叶中均鉴定出种相同的酚酸类成分，分别为对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛、对香豆酸和阿魏酸。

　　2.1不同生长时间的半夏须根中酚酸含量的积累变化

　　不同生长时间的半夏须根中酚酸含量测定结果如表所示，半夏须根中总酚酸含量范围为238.59~578.65μ−，不同生长时间总酚酸含量存在显著性差异<0.05，随生长时间的延长，总酚酸含量呈波动上升的趋势，当生长时间为90时达到最高，约为生长15含量的2.4倍。同一时期各酚酸的含量均有所差异，具体表现为对香豆酸>香草醛>对羟基苯甲酸>香草酸>阿魏酸>丁香酸，含量最高的对香豆酸约为含量最低的丁香酸63倍。随生长时间的延长，须根中的种酚酸的含量皆呈波动上升的趋势，且存在显著性差异<0.05，除丁香酸在60时含量达到最高外，其余种酚酸均在90时含量达到最高。

　　2.2不同生长时间的半夏块茎去皮中酚酸含量的积累变化

　　不同生长时间的半夏块茎去皮中酚酸含量测定结果如表所示，半夏块茎去皮中总酚酸含量范围为9.86~16.58μ−，不同生长时间总酚酸含量之间存在显著性差异<0.05，随生长时间的延长，总酚酸呈先升后降的趋势，当生长时间为60时达到最高，约为生长15含量的1.7倍。在同一时期半夏块茎中各酚酸的含量有所差异，具体表现为香草醛>香草酸>对羟基苯甲酸>丁香酸>阿魏酸>对香豆酸，香草醛含量约为对香豆酸的倍。随生长时间的延长，块茎去皮中除丁香酸呈逐渐升高的趋势外，其余种酚酸的含量皆呈先升后降的趋势，且存在显著性差异<0.05，对羟基苯甲酸和香草醛在45时含量达到最高，香草酸和阿魏酸在45时含量达到最高，对香豆酸和丁香酸分别在75和90时含量达到最高。

　　2.3不同生长时间的半夏块茎皮中酚酸含量的积累变化

　　不同生长时间的半夏块茎皮中酚酸含量测定结果如表所示，半夏块茎皮中总酚酸含量范围为324.58~399.91μ−，不同生长时间总酚酸含量存在显著性差异<0.05，随生长时间的延长，总酚酸含量呈波动上升的趋势，当生长时间为90时含量达到最高，约为生长60时含量的1.2倍。半夏块茎皮中各酚酸的含量有所差异，具体表现为香草醛>香草酸>对羟基苯甲酸>阿魏酸>对香豆酸>丁香酸，香草醛含量约为丁香酸的31倍。随生长时间的延长，块茎皮中除对羟基苯甲酸外，其余种酚酸皆呈波动上升的趋势，且存在显著性差异<0.05。

　　2.4不同生长时间的半夏叶中酚酸含量的积累变化

　　不同生长时间的半夏叶中酚酸含量测定结果如表所示。总酚酸含量范围为18.94~70.04μ−，不同生长时间总酚酸之间存在显著性差异<0.05，随生长时间的延长，总酚酸呈逐渐上升的趋势，当生长时间为90时达到最高，约为生长15含量的3.7倍。叶中各酚酸的含量有所差异，具体表现为香草醛>香草酸>对羟基苯甲酸>对香豆酸>丁香酸、阿魏酸，香草醛含量约为丁香酸的倍。随生长时间的延长，叶中除阿魏酸含量呈先升高后降低的趋势外，其余种酚酸含量皆呈波动上升的趋势，且存在显著性差异<0.05，除香草酸、阿魏酸分别在60和75时含量达到最高外，其余酚酸均在90时含量达到最高。

　　2.5不同生长时间的半夏根际土中酚酸含量的积累变化

　　不同生长时间的半夏根际土中酚酸含量测定结果如表所示，半夏根际土中总酚酸含量范围为0.5773~1.2694μ−，不同生长时期总酚酸含量存在显著性差异<0.05，随时间的延长总酚酸含量呈先升后缓慢下降的趋势，当生长时间为75时达到最高，约为生长15含量的2.2倍。根际土中各酚酸的含量有所差异，具体表现为对香豆酸>对羟基苯甲酸>香草醛>香草酸>丁香酸>阿魏酸，对香豆酸含量约为阿魏酸含量的22倍。随生长时间的延长，根际土中除对香豆酸含量呈逐渐升高的趋势外，其余酚酸的含量皆呈先升后降的趋势，且存在显著性差异<0.05，除丁香酸和对香豆酸分别在60和90时含量达到最高外，其余酚酸均在75时含量达到最高。

　　2.6半夏植株不同部位酚酸最终积累量

　　半夏植株不同部位酚酸最终积累量测定结果如表所示，半夏植株不同部位酚酸除丁香酸和对香豆酸外，其余酚酸的最终积累量均存在显著性差异<0.05，总酚酸积累量以半夏须根最高，块茎去皮最低，大小规律为：须根>茎皮>叶>块茎去皮)(0.01，须根约为块茎去皮的42倍。半夏植株中种酚酸的积累规律为：对香豆酸>香草醛>香草酸>对羟基苯甲酸>阿魏酸>丁香酸，其中对香豆酸积累量以须根最高，达410.92μ−，块茎去皮最低，须根积累量约为块茎去皮积累量的708倍。对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛和阿魏酸则均以块茎皮积累量最高，块茎去皮最低。

　　3讨论(Discussion)

　　半夏植株各部位总酚酸最终积累量的规律为须根>块茎皮叶>块茎去皮;随生长时间的延长，半夏植株不同部位中种酚酸不断积累，均在60~90时达到最高，其中对香豆酸含量最高，且大部分存在于须根中，此时半夏根际土中对香豆酸和总酚酸含量达到最高。实验所用根际土为石英砂，故最终半夏根际土中对香豆酸和总酚酸均来自半夏植株，推测半夏分泌的酚酸类物质对香豆酸占主要地位。

　　半夏块茎去皮的对香豆酸和总酚酸均是先增加后降低，但最终块茎去皮的对香豆酸和总酚酸较初始时有所增加的。第天半夏块茎去皮中对香豆酸和总酚酸开始降低，而第天时半夏须根和块茎皮中的对香豆酸和总酚酸开始急剧增加，推测半夏块茎去皮中的对香豆酸和总酚酸均向半夏的须根和块茎皮中转移。当对香豆酸浓度达到109.33μ−时，能显著降低半夏种茎的发芽率，而在第天时半夏须根中的对香豆酸含量为10.92μ−，远大于胁迫的浓度。

　　据此可以推测半夏植株会向土壤中释放酚酸，使得半夏土壤中总酚酸和对香豆酸达到胁迫的阈值，从而使得半夏在连作过程中产生化感自毒作用。何志贵[11]的研究表明，化感自毒物质是引起半夏连作障碍的重要因素，其中酚酸是其重要的组成成分。张丹等15的研究表明栽培过程中随黄连生长年限的增加，连作地土壤中总酚酸的含量均表现为增加。吴立洁等[12]研究发现，三七根际土壤中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸和苯甲酸种酚酸类物质是由三七植物须根残体腐解产生。

　　徐小军等[1的研究表明，随着阿魏酸质量浓度的提高，西瓜根和茎中的超氧阴离子浓度及膜质过氧化程度显著增加;张恩平等[1研究发现，苯甲酸和肉桂酸会破坏番茄根部保护酶系统的平衡，造成了根系的膜质过氧化，沈玉聪等[1在研究酚酸类物质对三七幼苗的化感影响时发现，外源性添加对香豆酸会降低幼苗根系活力和株高。有研究表明，对香豆酸处理幼苗后，植株体内可溶性蛋白含量、过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性以及超氧化物歧化酶活性均有所降低，从而抑制了小麦的地下根的生长[1。对香豆酸处理大豆后会显著降低干物质产量、叶片膨胀、高度、叶片产量、净同化率单位叶面积干物质产量的比率和叶面积持续时间处理间隔期间存在的总叶面积20。

　　据此分析，本研究中当半夏植株的须根中的对香豆酸浓度≥09.33μ−时，须根的抗氧化酶系统皆开始遭到破坏，无法抵抗对香豆酸引起的自毒作用，最终抑制了半夏幼苗的生长发育，乃至通过影响半夏根系的生长发育和植株叶片的化合作用引起半夏长期连作的提前倒苗，进而导致减产和土壤病的发作。推测半夏产地的连作障碍可能是每年半夏采收后残留的须根残体经腐解后产生了对香豆酸、阿魏酸和对羟基苯甲酸等酚酸类物质，对其产生了毒害作用。Ba等[21]研究发现，烟草的连作降低土壤pH，促进酚酸积累，从而改变细菌群落结构和多样性，最终影响烟草生长。有研究发现，对香豆酸通过增加镰刀菌型等有害菌群，减少有益菌群，改变了黄瓜根际细菌和真菌群落的结构和组成，导致黄瓜发生自毒效应[22−23]。

　　据此分析，在半夏产地长期连作过程中，土壤中的对香豆酸不断积累，在这个过程中对香豆酸可能会改变半夏土壤中的微生物平衡，通过促进有害微生物增加，抑制有益型微生物的生长，从而导致半夏的化感自毒作用。本研究发现对香豆酸浓度达到较高浓度时能显著抑制半夏种茎的萌发，在不同时间段半夏植株各部位酚酸最终积累量均是以半夏须根中对香豆酸含量最高，可以推测半夏植株特别是半夏须根可能是连作土壤中酚酸类化感物质的潜在来源，对香豆酸为重要的酚酸类化感物质，对香豆酸可能为半夏植株中重要的次生代谢产物，其对半夏植株生长的意义还有待进一步研究。

　　综上所述，半夏植株不同部位均含相同的种酚酸类成分，分别为对香豆酸、香草醛、香草酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸和丁香酸，其总酚酸含量以半夏的须根最高，规律为须根>块茎皮叶>块茎去皮。随生长时间的延长，半夏的块茎皮、须根、叶和根际土中的对香豆酸和总酚酸呈波动上升的趋势，不断积累，最终在第天时达到最高;而半夏块茎去皮中的对香豆酸和总酚酸在时达到最高，但此时半夏块茎去皮的对香豆酸和总酚酸开始向半夏的须根和根际土壤中转移，进一步使半夏须根和根际土在第天时积累的对香豆酸和总酚酸含量达到更高。

　　参考文献(Reference)：

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　　[4]孙雪婷,李磊,龙光强,等.三七连作障碍研究进展[J].生态学杂志,2015,34():885893SunXT,LiL,LongGQ,etal.TheprogressandprospectonconsecutivemonocultureproblemsofPanaxnotoginseng[J].ChineseJournalofEcology,2015,34(3):885893(inChinese)

　　作者：万子玉，李巧，赖月月，刘佳灵，敬勇，李敏