促生菌对基质栽培番茄根系细菌群落的影响

　　摘要：【背景】植物促生菌剂产品在农业生产上的应用越来越广泛，但人们对促生菌在基质栽培条件下对作物根系微生物群落影响的了解有限。【目的】明确在基质栽培条件下，促生菌假单胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Z54对番茄生长和根系细菌群落的影响。【方法】通过蘸根和灌根处理，分别将2株促生菌接种到基质栽培的番茄上。通过对番茄苗期各生长指标调查，明确促生菌对番茄生长的影响。利用16SrRNA基因扩增子测序技术，分析接种促生菌对番茄根系细菌群落组成和结构的影响。【结果】两种促生菌均能促进番茄生长：JP2-3处理组的4种生长指标(株高、茎粗、最大叶长、最大叶宽)均比对照组大;除茎粗外，Z54处理组其余3种指标均大于对照组。接种JP2-3和Z54改变了番茄根系细菌群落的α多样性，丰富度指数和多样性指数都比对照组低，而且Z54处理组降低更为显著(<0.05)。接种菌株Z54使根系细菌群落的β多样性发生了明显变化，而菌株JP2-3对β多样性影响相对较小。番茄根系细菌群落的主要优势菌门有：变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteriodetes);主要优势菌属有：链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、艾德昂菌属(Ideonella)、德沃斯氏菌属(Devosia)等。在门水平上，基质栽培的番茄根系细菌群落组成与土壤栽培相似，但在属水平上有较大差异。接种JP2-3提高了艾德昂菌属(Ideonella)、游动放线菌属(Actinoplanes)和水居菌属(Aquincola)等菌属的相对丰度;接种Z54则提高了短波单胞菌属(Brevundimonas)和黄杆菌属(Flavobacterium)等菌属的相对丰度。在上述相对丰度增加的菌属中，有多种细菌是植物益生菌。基于线性判别效应量分析(LEfSe)的结果表明，JP2-3处理组的生物标志物主要集中分布于β-变形菌纲(Betaproteobacteria)和放线菌纲(Actinobacteria)，而Z54处理组主要集中于γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)。【结论】在基质栽培条件下，施用假单胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3和枯草芽孢杆菌(.subtilis)Z54，对番茄根系细菌群落组成和结构产生了不同的影响。两种菌分别提高了不同土著有益微生物的相对丰度，在促生菌和土著有益微生物的协同作用下促进了番茄的生长。

　　关键词：促生菌;高通量测序;基质栽培;微生物群落

　　番茄(Solanumlycopersicum)含有丰富的番茄红素、维生素、矿物质等营养物质，深受人们喜爱，是世界上种植范围最广、总产量最高的蔬菜作物之一。随着设施农业的逐渐发展，番茄在我国的栽培面积不断扩大，已成为种植面积排名第四的蔬菜品种[1]。由于常年重茬连作以及化肥农药的不合理使用，导致土传病害发生严重、土壤质量不断下降，制约了设施农业的可持续发展。

　　植物栽培论文：酱用番茄落花落果原因及预防脱落措施

　　然而无土栽培是解决上述连作障碍问题的有效途径[2]，其中，基质栽培因其具有技术要求低、前期投资少、病虫害少、节水节肥、栽种灵活、可控性较高等优点，在实际生产中应用最广泛[3]。目前常用的栽培基质由草炭、菌渣、秸秆、稻壳、蛭石、炉渣、珍珠岩等有机和无机原料混配而成[4]，具有透气、保湿、轻质等优点。

　　正常生长的植物根系富集了各种各样的微生物，其中有大量的植物促生菌(PlantGrowthPromotingRhizobacteria,PGPR)，这类微生物一般通过生物固氮或溶磷作用为植物提供氮素及磷素营养物质[5]，另外还有一些PGPR可以分泌抗生素、植物激素等代谢产物以及产生铁载体等物质，促进植物根系吸收矿物质和水分，进而促进植物的生长发育，抑制病原微生物生长，减少植物病害的发生[6-7]。常见促生菌有芽孢杆菌属(Bacillusspp.)、假单胞菌(Pseudomonasspp.)、放线菌(Actinomycesspp.)、根瘤菌(Rhizobiumspp.)和木霉菌(Trichodermaspp.)等[8-9]。其中有多种微生物已开发成商品化菌剂，随着人们对化肥农药滥用危害的关注以及对健康和环境问题的重视，植物促生菌剂产品在农业生产上的应用越来越广泛，具有广阔的应用前景。

　　健康植物的根系微生物通过竞争和协作形成了比较稳定的群落结构，这些微生物对于植物的生长发育、抗病、抗逆至关重要[10]。以往的研究往往关注对基质养分的优化，对基质中的微生物群落了解较少。近年来，随着微生物组测序、高通量培养、人工重组体系等方法的建立及应用，极大地提高了人们对根系微生物群落结构和功能的认知能力和水平，已发现土壤理化性质、植物基因型、根系构型等因素对根系微生物群落具有较大影响[10-11]。

　　栽培基质的组成与土壤有较大的不同，与土壤相比，基质的缓冲能力非常低。关于添加促生菌对基质栽培作物根系微生物群落产生的影响目前人们了解较少。本研究通过在番茄的基质栽培过程中接种促生菌，检测菌株对番茄生长的影响，并利用扩增子高通量测序技术分析接种促生菌对番茄根系细菌群落组成和结构的影响，以期为促生菌在番茄基质栽培中的应用提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1番茄品种鲁青娇粉，由山东鲁青种苗有限公司提供。

　　1.1.2促生菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Z54和假单胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3，本实验室保存。其中，枯草芽孢杆菌Z54对多种植物病原菌具有生防效果，而且能促进植物生长[12];假单胞菌JP2-3具有较强的溶磷能力，可以促进作物生长[13]。

　　1.1.3栽培基质栽培基质由山东商道生物科技股份有限公司提供，主要原料为稻壳、牛粪、作物秸秆等，按1:1:2比例掺混腐熟而成。

　　1.2番茄的栽培温室试验在济南市鲁青生态蔬菜体验中心(117.1039°E，36.5841°N)进行。栽培方式采用槽式栽培，栽培槽采用挖沟槽铺塑料膜的方式。栽培槽的形状为梯形，上口宽60cm，底宽40cm，深度20cm。槽面覆盖0.01mm的塑料膜，然后填加栽培基质至稍高出栽培槽口。

　　1.3促生菌接种液的制备划线接种B.subtilisZ54和Pseudomonassp.JP2-3到LB平板上，置于培养箱中30°C培养48h，然后分别挑取单菌落接种于营养肉汤培养基中，30°C、180r/min条件下培养72h。取细菌培养液于8000r/min离心10min，弃上清，加无菌水洗涤菌体沉淀2次，重悬菌体，调整菌液浓度为1×108CFU/mL。

　　1.4接种方式

　　分2次进行接种，第1次在番茄移栽前进行蘸根处理，将待定植的番茄苗根部置于浓度为1×108CFU/mL菌液中浸泡5min，然后进行移栽。第2次在定植后第7天进行灌根处理，在每株番茄根部浇灌20mL浓度为1×108CFU/mL菌液。以清水作为对照，每个处理设置3个小区重复，每个小区面积为1.5m×12m，各处理的小区在温室内随机分布。

　　1.5番茄生长指标的调查

　　在定植后的第14天，调查菌株对番茄生长的影响，采取随机取样调查，每个处理调查10株番茄，调查的指标包括株高、茎粗、最大叶长和最大叶宽。

　　1.6根系样品的采集

　　在定植后的第30天，进行番茄根系样品的采集。样品采集方法参考胡雅丽等[14-15]的方法，每种处理随机取6株番茄，取样时用铁锹向下挖取约15cm，取出其中番茄的根，抖落根上携带的基质，将番茄的根全部剪下，粗剪成段，混匀，抓取一部分装入50mL的离心管中。每个离心管加入35mL的磷酸盐缓冲液，在转速为180r/min的摇床上振荡清洗20min，将根转入新的50mL离心管，再重复上述清洗步骤2次。

　　1.7样品DNA提取及高通量测序

　　采用植物DNA提取经典方法(CTAB法)，提取番茄根系样本的总DNA。提取结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，使用NanoDrop2000检测DNA浓度。用无菌水将获得的适量DNA稀释至1ng/μL，以此作为PCR扩增模板，对细菌16SrRNA基因的V5−V7可变区进行PCR扩增。PCR扩增使用的是Phusion®High-FidelityPCRMasterMix试剂盒，扩增体系参照试剂盒的使用说明，扩增引物为799F(AACMGGATTAGATACCCKG)和1193R(ACGTCATCCCCACCTTCC)。

　　PCR反应条件：98℃1min;98℃10s，50℃30s，72℃30s，30个循环;72℃5min。PCR产物经琼脂糖凝胶回收后，使用TruSeq®DNAPCR-FreeSamplePreparationKit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和QPCR定量，文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序，每个样本测序数据量为50000tags以上。高通量测序工作在北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

　　1.8数据处理及生物信息学分析

　　下机数据处理与分析参照Liu[16]的方法进行。利用Vsearch合并双端测序数据，根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从合并的序列中截去Barcode和引物序列，并进行序列质控和去冗余[17]。然后使用Usearch对有效序列进行非聚类法去噪，获得扩增序列变体(AmpliconSequenceVariants,ASVs)[18]，基于RibosomalDatabaseProject数据库(RDP)去除嵌合体和进行物种注释[19]。使用Usearch计算α多样性指数、稀释曲线、β多样性等，使用R语言(version4.1.0)对样品物种组成及相对丰度统计结果绘制箱线图、韦恩图(Venn)、主坐标分析图(PrincipalCo-ordinatesAnalysis,PCoA)和堆叠柱状图等。通过LEfSe分析获得不同处理的生物标志物，其中筛选标准设置为LDAscore>2。

　　2结果与分析

　　2.1促生菌对番茄生长的影响

　　在番茄定植14天后，通过对番茄生长指标的调查，判断菌株对番茄生长的影响。接种促生菌的2个处理组番茄植株的株高、最大叶长、最大叶宽指标均比对照组CK要大。对于上述3个指标，菌株Z54处理的促生效果都比菌株JP2-3明显。然而对于番茄茎粗的影响，接种菌株Z54的处理比对照CK略小，菌株JP2-3处理比对照CK大。根据统计分析，接种促生菌显著增加了番茄最大叶长(P<0.05)，而对另外3个生长指标的影响不显著。造成差异不显著的原因是，苗期生长受种子的影响较大，番茄植株个体之间差异较大，各生长指标数值比较离散。总体来说，接种枯草芽孢杆菌(B.subtilis)Z54和假单胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3都能促进番茄的生长发育。

　　2.2番茄根系微生物物种组成情况

　　基于RDP数据库，对3组处理18个样品的扩增子序列进行分析和物种注释，共获得1978个细菌ASVs，鉴定出细菌17门32纲64目140科301属。在门水平上，番茄根系细菌群落的优势菌门有变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteriodetes)，这4个门的相对丰度占总体的90%以上，其中变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度最高。该结果与其他研究报道的土壤栽培番茄根系细菌群落组成相似，说明尽管基质与土壤的理化性质存在较大差异，但番茄根系细菌群落在门水平上的组成比较相似。

　　通过对3组样本的稀释曲线(图3)进行分析，发现从样本中随机抽取一定测序量的数据，Richness数目先快速上升而后趋于平缓，说明随着测序量的增大，初期检出大量物种，后期样本群落的物种丰富度变化趋缓，低丰度物种逐渐被检出，物种丰富度上升速率降低，说明测序量已基本达到饱和，能比较完整地反映细菌群落的结构和种类。从稀释曲线上可以看出，各组样品的丰富度大小顺序为CK>JP2-3>Z54，说明接种促生菌降低了番茄根系细菌群落的丰富度，其中Z54的影响最大，推测其原因是Z54对其他细菌具有较强的抑制作用。

　　对3组处理样本中相对丰度≥0.05%的细菌ASVs进行统计和比较。CK、JP2-3和Z54组的ASVs数目分别为275、263和244，其中3组共有ASVs数目为114，各自特有的ASVs分别为55、52和111，分别占各组总ASVs数的20%、19.8%和45.5%。Z54处理组特有ASVs数最多，说明Z54组较另外2组有更多的特有微生物种类。三组之间两两比较，JP2-3组与CK组共有的ASVs数目最大，为206个，高于Z54与JP2-3组(119)或Z54与CK组共有ASVs数(128)，说明与Z54组相比，JP2-3组与CK组的微生物种类具有更好的相似性。上述结果表明，接种JP2-3和Z54都引起了番茄根系细菌组成的变化，其中Z54的影响更大。

　　2.3不同处理的番茄根系微生物群落的α多样性

　　α多样性是指特定群落或生境内的物种多样性，常用指标为ACE、Chao1、Richness、Shannon指数等，前3个指标反映物种丰富度，Shannon指数同时表征丰富度和均匀度，反映了细菌群落多样性。接种促生菌后，对番茄根系细菌群落的α多样性指数影响如图5所示，各组ACE、Chao1和Richness指数大小顺序为：CK>JP2-3>Z54。其中CK组和JP2-3组组间差异不显著(P>0.05)，而与Z54组组间差异显著(P<0.05)，即接种促生菌JP2-3降低了细菌群落丰富度，但差异不明显，而接种促生菌Z54显著降低了细菌群落的丰富度。

　　JP2-3组和Z54组的Shannon指数低于CK组，说明添加促生菌降低了番茄根系细菌群落多样性和均匀度，而且Z54处理组与CK组差异显著(P<0.05)。上述结果表明，接种JP2-3和Z54降低了番茄根系细菌群落的丰富度和均匀度，其中Z54的影响比较显著。这可能是由于枯草芽孢杆菌Z54能产生抗生物质，抑制了其他细菌的生长，从而显著降低了细菌群落的丰富度和均匀度;而假单胞菌JP2-3对其他细菌的抑制作用较弱，因此影响不显著。

　　3讨论与结论

　　本研究利用16SrRNA基因扩增子高通量测序技术分析了基质栽培的番茄在分别接种促生菌枯草芽孢杆菌(B.subtilis)Z54和假单胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3后的根系细菌群落组成和结构，通过比较不同处理之间的细菌群落结构，解析了在基质栽培条件下接种2种促生菌引起的番茄根系细菌种群变化差异。通过文献检索，我们未发现相同的研究报道。

　　因此，本研究结果对于了解促生菌在基质栽培条件下引起的作物根系细菌群落变化提供了重要信息，为指导促生菌在番茄基质栽培中的应用提供了理论依据。本研究发现，在基质栽培条件下，番茄根系细菌优势物种主要有变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteriodetes)等，其中变形菌门的相对丰度占比最大。

　　该结果与其他研究报道的土壤栽培番茄根系细菌群落组成相似。例如：Lee等[20]收集了韩国7个地区23个温室土壤种植的番茄样品，检测发现这些番茄根系细菌群落的优势菌门为变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门;Cheng等[21]对11个番茄品种的根系细菌群落进行研究，发现变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门等占优势。通过与上述结果比较，我们还发现在土壤栽培条件下，其他菌门的相对丰度比基质栽培条件下高，说明土壤栽培条件下番茄根系细菌群落的多样性更高。

　　在属水平上，Lee等[20]发现番茄的19个核心OTU隶属于12个菌属，其中仅有链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)3个属在本研究的优势菌属中发现，表明基质栽培和土壤栽培的番茄根系细菌种群在属水平的组成上存在较大差异。Cheng等[21]的研究中也比较了一个番茄品种在5种土壤和2种基质中的根系细菌群落，发现在不同土壤中番茄根系细菌种群在组成和结构上相对比较保守，但与基质中有显著的不同。

　　接种促生菌假单胞菌JP2-3后降低了番茄根系细菌群落的丰富度和多样性，但与CK组相比差异不显著(P>0.05)。刘辉等[22]的研究发现了相似的结果，单独接种溶磷细菌荧光假单胞菌JW-JS1可以提高NL-895杨根系土壤微生物群落的物种均匀性，但降低了微生物种群的多样性。

　　在门水平上，接种JP2-3的处理组中细菌群落的优势物种种类未变化，但放线菌门的相对丰度略有上升。这与罗路云等[23]的研究结果一致，喷洒沼泽红假单胞菌菌剂PSB06可以改善土壤微生物区系，提高土壤中放线菌所占的相对丰度，而放线菌是土壤中的主要类群，可以抑制土壤病害、促进土壤养分循环。在属水平上，接种JP2-3后，增加的优势菌属主要有艾德昂菌属(Ideonella)、游动放线菌属(Actinoplanes)和水居菌属(Aquincola)。Ideonellasp.TH17[24]被报道可以有效去除NH4+-N，将其转化为生物质氮。

　　Actinoplanes[25]则被报道具有产生吲哚乙酸、铁载体及磷酸盐增溶活性，还对水稻病原菌有拮抗能力，能够显著促进水稻幼苗生长。可见，接种假单胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3在一定程度上能够提高植株中有益微生物的相对丰度。接种枯草芽孢杆菌(B.subtilis)Z54之后，降低了番茄根系土壤中细菌群落的丰富度和多样性指数且结果显著(P<0.05)，表明添加Z54对土壤细菌群落的α多样性有显著影响。此外，β多样性分析结果表明，添加Z54组改变了土壤细菌群落的β多样性，土壤细菌群落结构产生了差异性变化。

　　Qiao等[26]的研究发现，根系定殖枯草芽孢杆菌PTS-394对番茄根系微生物群落也有过短暂影响变化，对细菌群落仅持续3d。然而Han等[27]在研究使用解淀粉芽孢杆菌B1408调节根系微生物群落来抑制黄瓜枯萎病时，结果发现细菌多样性显著增加;Wang等[28]的研究施用芽孢杆菌FKM10进行盆栽试验，结果表明与对照组相比，处理组细菌丰富度和多样性增加，土壤微生物群落结构发生变化。

　　在属水平上，接种Z54处理主要使短波单胞菌属(Brevundimonas)和黄杆菌属(Flavobacterium)的相对丰度增加。孙卓等[29]从人参根系土壤分离得到的一株土壤短波单胞菌对人参锈腐病具有防治作用。Kwak等[30]基于宏基因组学分析从番茄根系鉴定和分离到一株黄杆菌，其能有效抑制番茄青枯病的发生。

　　因此，接种枯草芽孢杆菌(B.subtilis)Z54在一定程度上也提高了番茄根系有益微生物的相对丰度。 根系微生物发挥着重要的功能，如为植物提供营养、矿物质和维生素，并保护植物免受生物和非生物的胁迫，对于维持植物健康具有重要作用。土著根系微生物种群作为一种生态屏障，帮助植物抵御外来微生物的入侵。研究表明，微生物种群的多样性和均匀性越高，抵抗环境胁迫和生物胁迫的能力往往越强。

　　外源植物促生菌可以通过提供养分、平衡植物激素状态、诱导抗性、改变根系分泌物组成等方式改变根系微生物种群的组成和结构。Berg等[31]将外源促生菌调节植物根系微生物的作用归纳为6种类型：短暂的微生物群落变化;微生物多样性的稳定或增加;微生物群落均匀度的稳定或增加;恢复微生态平衡;增加有益微生物;减少潜在的病原菌等。马慧媛等[32]将含有哈茨木霉和巨大芽孢杆菌的菌剂接种到茄子根际，显著提高了微生物群落的多样性，并且提高了芽孢杆菌、假单胞菌等有益微生物的占比。本研究发现，接种促生菌Z54、JP2-3分别增加了不同有益微生物的相对丰度，但是降低了微生物群落的多样性，尤其是Z54的影响更为显著。

　　推测菌株Z54造成细菌群落显著变化的原因是该菌株为高活性拮抗菌，能产生多种拮抗物质，对其他微生物产生了抑制作用，而基质的生态缓冲能力较弱，从而降低了微生物群落的丰富度和多样性。基质中的微生物多样性较低，生态平衡更容易被破坏，而在基质中接种促生菌可提高土著有益微生物的相对丰度，在促生菌和土著有益微生物的协同作用下，有利于预防病害发生、促进作物生长。

　　因此，在基质栽培条件下，接种促生菌对于维持作物健康、减少农药化肥的使用具有重要意义。促生菌在作物根部的定殖、增殖和存活能力对于菌株促生和生防效果的稳定性具有重要影响[33]。由于扩展子测序技术的局限，本研究的结果只是对菌群的相对定量，未对接种的促生菌在番茄根际定殖水平进行绝对定量。

　　近期的一些研究进展对将来的研究提供了很好的参考，例如：Zhang等[34]通过AFLP鉴定出B.subtilisNCD-2和P.protegensFD6的特异片段，然后基于实时定量PCR技术建立了特异的检测方法，研究了上述菌株在小麦根际的定殖情况;Guo等[35]报道了一种宿主相关定量丰度分析方法，该方法可以通过微生物标记基因与植物基因组的拷贝数比值，准确地检测相对于宿主植物的微生物总量和根微生物组成员的定殖情况。

　　基于上述方法，可以更加准确地了解促生菌在植物根系的定殖情况以及根系微生物种群变化情况。综上所述，在基质栽培条件下，施用假单胞菌(Pseudomonassp.)JP2-3和枯草芽孢杆菌(.subtilis)Z54促进了番茄生长。基质栽培番茄根系细菌群落组成在门水平上与土壤栽培相似，但在属水平上有较大差异。

　　接种这2种促生菌改变了番茄根系细菌群落的α多样性，群落的丰富度指数和多样性指数都被降低，而且Z54处理组降低更显著。两种促生菌对番茄根系细菌群落的组成和结构产生了不同的影响，菌株Z54使番茄根系细菌群落多样性发生了明显变化，而菌株JP2-3对群落多样性影响相对较小。接种2种促生菌，分别增加了不同土著有益微生物的相对丰度，有助于促进植物健康生长。上述结果是对基质栽培条件下促生菌微生态效应的初步探索，将来的研究可以通过宏基因组学和培养组学等多组学结合的手段研究根系微生态的功能，为阐明促生菌的作用机制提供重要信息。

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　　作者：李凤1，周方园1，张广志1，周红姿1，吴晓青1，吴金娟2，张新建1