靶向蛋白质组学技术在多物种奶及其奶制品鉴别中的应用研究

　　摘要基于靶向蛋白质组学技术，采用超高效液相色谱-串联高分辨质谱/串联三重四极杆质谱，建立了一种鉴别奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼共8个物种奶的分析方法。针对8个物种奶中6种乳蛋白酶解产生的特征多肽进行分析，利用同位素内标法实现多条多肽的同时检测及比较，通过理论多肽分析、实际多肽检测、干扰考察、线性与最大酶解时间比较，最终筛选出13条特征多肽。依据13条特征多肽对模拟混合奶样品中的不同物种奶进行分析，对市售16个奶制品中的奶源物种进行鉴别。结果表明，特征多肽在奶源物种鉴别中具有良好的稳定性与特异性，本方法对多物种奶制品行业的质量控制与监管具有参考价值。

　　关键词靶向蛋白质组学;液相色谱-质谱联用技术;物种鉴别;乳蛋白

　　奶制品是日常膳食体系中常见的饮品和营养摄入源之一。常见的奶制品除奶牛奶外，还有山羊奶、绵羊奶、水牛奶、牦牛奶、马奶、驴奶和骆驼奶等产量较少的奶源，这些奶各具独特营养价值[1-4]。例如，山羊奶致敏性低[5]，含有大量的脂肪和蛋白微粒，容易水解吸收[6-7];驴奶富含乳清蛋白，其乳清蛋白与酪蛋白的比例与人乳接近，更易于吸收[7];骆驼奶含有比奶牛奶高30倍的维生素C[8]，并且富含内胰岛素，可作为治疗糖尿病的辅助食品[9-10]。

　　蛋白质论文范例： 蛋白质-蛋白质相互作用的实验检测方法

　　由于产量少且营养价值高，这些奶在市场上的价格高于奶牛奶。在利益的驱使下，这些奶及其奶制品在加工过程中存在掺入奶牛奶或直接以奶牛奶冒充等问题。因此，建立奶制品物种成分的鉴别方法以识别不同物种奶，对于奶制品行业的品质监管具有重要意义。目前，有关不同物种来源奶(简称多物种奶)的鉴别研究已有许多报道，例如，聚合酶链式反应法(PCR)[11]、酶联免疫吸附分析法(ELISA)[12]、凝胶电泳法[13]、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)[14-15]和基质辅助激光解吸-飞行时间质谱法(MALDI-TOF)[16]等。PCR和ELISA法通过基因或抗原抗体免疫结合实现对多物种奶中标志物的识别，具有较高的灵敏度。

　　但是，该类检测方法通常仅适用于定性或半定量分析，并且易出现假阳性结果。HPLC-MS和MALDI-TOF法通过分子质荷比的分析实现对目标蛋白质的特异性识别。但是，由于蛋白质分子量大、修饰多，在诸如高温灭菌奶、乳粉等奶制品加工过程中，其结构组成容易因温度、压力等因素的影响而发生变异，使检测方法容易受到干扰。靶向蛋白质组学技术[17-18]是一种基于已知蛋白质氨基酸序列信息，利用蛋白酶水解结合HPLC-MS技术，筛选出待测目标蛋白质的特征多肽，并通过对特征多肽的检测实现目标蛋白质定性和定量分析的方法。

　　由于特征多肽序列短、质量数小、检测的灵敏度和稳定性高，并且其结构组成在加工过程中受温度和压力等因素的影响较小[19]，因此在全脂粉和婴儿配方奶粉[20]等检测中具很强的抗干扰能力。目前，靶向蛋白质组学技术已在水牛与奶牛乳清蛋白特征多肽鉴别[21-22]、山羊与奶牛的乳清蛋白差异分析[23]等方面得到应用。Camerini等[21]利用靶向蛋白质组学技术分析了水牛奶酪中残留的乳清成分，并建立了鉴别水牛与奶牛β乳球蛋白的分析方法。

　　Ke等[24]利用靶向蛋白质组学技术对山羊奶与奶牛奶中6种乳蛋白的特征多肽进行了对比与筛选，利用特征多肽实现了山羊奶制品中奶牛奶成分掺假的检测。但是，目前的研究通常仅针对少数物种奶与奶牛奶的鉴别分析，由于奶制品行业中奶源物种繁多，建立一种针对多物种来源乳制品的同时检测方法，有利于更全面地分析奶制品的物种来源，实现大批量奶制品的快速鉴别。本研究基于靶向蛋白质组学和液相色谱-质谱法相结合的鉴别方法，建立了奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼8个物种奶的物种鉴别方法。本方法利用胰蛋白酶酶解技术和同位素二甲基衍生化技术作为辅助，实现了对物种的特征多肽的检测，并鉴别了模拟样品与实际奶制品中乳蛋白的物种来源。

　　1实验部分

　　1.1仪器与试剂

　　Q-Exactive超高效液相色谱组合型四极杆Orbitrap质谱仪(UHPLC-OrbitrapMS，美国ThermoFisher公司);TQ-XS超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪(UHPLC-TQMS，美国Waters公司);CascadaⅠ型超纯水仪(美国Pall公司)二硫苏糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)、氰基硼氢化钠(HPLC级，美国Sigma-Aldrich公司);甲醛、同位素甲醛(13CD2O)(HPLC级，美国Sigma-Aldrich公司);NaHCO3、氨水(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司);乙腈(ACN)、甲酸(FA)(HPLC级，德国Merck公司);测序级重组胰蛋白酶(Trypsin，上海雅心生物科技有限公司)31个纯鲜奶样(奶牛奶5个、水牛奶3个、牦牛奶5个、山羊奶5个、绵羊奶2个、驴奶和马奶各3个、骆驼奶5个)均来自当地乳品企业。采样后，立即在-20℃冷冻储存。16个市售奶制品样品(水牛鲜奶2个、牦牛鲜奶1个、牦牛高温灭菌奶2个、牦牛乳粉1个、山羊鲜奶2个、山羊乳粉2个、绵羊乳粉2个、驴鲜奶1个、驴乳粉1个和骆驼鲜奶2个)通过网购或当地采购获得。

　　1.2标准曲线与模拟混合样品的配制

　　8个物种奶的标准样品由各物种鲜奶与超纯水混合配制，其混合比例(V/V)依次为0∶100、5∶95、10∶90、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20和100∶0。模拟混合样品由奶牛奶与其它7个物种奶分别混合获得，其混合比例(V/V)为0∶100，5∶95、10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、95∶5、100∶0。属内物种间混合样品，由牦牛奶与水牛奶，山羊奶与绵羊奶及驴奶与马奶两两混合获得，其混合比例(V/V)为0∶100、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20、100∶0。

　　1.3样品前处理

　　1.3.1酶解准确称取样品(乳粉样品0.05g，奶样0.5mL)，加入超纯水充分溶解，定容至10mL。移取稀释后的样品溶液100μL于2mL离心管中，加入100μL超纯水、500μL100mmol/LNaHCO3溶液、100μL100mmol/LDTT溶液，混匀，于70℃恒温反应30min;冷却至室温，加入100μL300mmol/LIAA溶液，避光静置30min;加入100μL100μg/mLTrypsin，混匀，于37℃恒温酶解4h，冷却至室温，15000r/min离心5min，待二甲基化。

　　1.3.2二甲基化反应从离心后样品溶液中吸取100μL上清液，加入4μL1%(V/V)甲醛溶液(同位素内标样品中加入等量同位素甲醛溶液)和4μL0.6mol/L氰基硼氢化钠溶液，在室温下反应1h。加入16μL1%(V/V)氨水，中止二甲基化反应，并加入10μL甲酸中和过量的氨水，于室温下静置至样品溶液不再产生气泡。取50μL二甲基化后的样品溶液与50μL同位素二甲基化的内标溶液混合，待测。

　　1.4液相色谱条件色谱柱:ACQUITYUPLCBEH300C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm，30nm);柱温35℃;进样量:10μL;自动进样器温度:15℃;色谱流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为0.1%甲酸-乙腈溶液，流速:0.3mL/min。梯度洗脱:0～1min，2%B;1～4.5min，2%～80%B;4.5～5.5min，80%～100%B;5.5～6.5min，100%B;6.5～7min，100%～2%B;7～9min，2%B。

　　1.5Orbitrap质谱条件鞘气流量:40L/min;辅助气流量:10L/min;离子源电压:3.5kV;毛细管温度:320℃;辅助气温度:350℃。质谱检测扫描范围:m/z200～3000;分辨率:70000;AGCtarget3e6;最大进样时间:100ms。dd-MS2参数为分辨率17500，AGCtarget1e5，最大进样时间为50ms，循环计数为10，质量间隔窗口为m/z4.0。蛋白质分析软件Proteomediscoverer2.1(美国Thermo-Fisher公司)参数为酶切模式Trypsin;漏切位点0～2;质量偏移为10ppm(10-6);氨基酸固定修饰:半胱氨酸的甲酰化，多肽N端以及赖氨酸的二甲基化;氨基酸的动态修饰:磷酸化和氧化。

　　1.6三重四极杆质谱条件毛细管电压:3.0kV;离子源温度:150℃;脱溶剂温度:350℃;脱溶剂气流量:800L/min;锥孔反吹气流量:150L/h;质谱碰撞气流量0.12mL/min。所得数据由Masslynx软件采集(美国Waters公司)。

　　2结果与讨论

　　2.1理论特征多肽的序列分析

　　常见的乳蛋白主要分为乳清蛋白和酪蛋白两大类，在乳清蛋白中，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是主要的组成部分;在酪蛋白中，αs1酪蛋白、αs2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白是主要的组成部分。这6种蛋白的含量常占乳蛋白组成的90%以上，是各物种最具代表性的乳蛋白。故本研究主要针对8个物种奶中的上述6个乳蛋白进行分析，其中，仅骆驼奶不含有β-乳球蛋白。

　　为了确定各乳蛋白中具有物种代表性的多肽，首先对乳蛋白的氨基酸序列进行了理论分析。通过Uniprot数据库查询，获得共计47种乳蛋白的氨基酸序列信息。通过模拟Trypsin酶切，对相应多肽进行特异性筛选[21，24]。以奶牛奶为例，对奶牛与其它7个物种乳蛋白的氨基酸序列进行了比较，在奶牛奶的6种乳蛋白中，筛选出6条在其它物种乳蛋白中无重复氨基酸序列的理论特征多肽。

　　通过美国国家生物信息中心(NCBI)网站提供的蛋白质数据库中的局部序列比对工具(BLAST)对这6条多肽在已知的8个物种蛋白质数据库中的信息进行比对分析，结果表明，在数据库中没有其它蛋白质包含与这6条多肽一致的氨基酸序列，证明这些多肽具有物种特异性。通过相同方式，在其余7个物种乳蛋白中筛选出总计110条理论特征多肽，详见电子版文后支持信息表S1～S7。

　　2.2理论特征多肽的静电场轨道阱质谱检测

　　为确认理论特征多肽是否存在于实际奶制品中，使用UHPLC-OrbitrapMS对按照1.3节所述步骤处理后的8个物种奶样中的多肽进行分析，并使用数据关联监测模式(ddms2)对多肽的二级质谱信息进行采集。采集到的数据通过软件Proteomediscoverer2.1进行处理，以Uniprot数据库信息作为参考，对8个物种奶样品的质谱数据进行筛选匹配。

　　2.3特征多肽的筛选

　　2.3.1特征多肽的二甲基衍生化

　　依据各候选特征多肽的OrbitrapMS数据，利用UHPLC-TQMS建立相应的多反应监测(MRM)检测方法。奶牛奶、水牛奶和牦牛奶候选特征多肽的MRM参数，其余物种的特征多肽MRM参数见电子版文后支持信息表S8～S10。为了克服质谱离子化效率及稳定性对候选多肽的影响，采用同位素标记法对候选特征多肽进行校正。

　　考虑到本研究包含的目标候选多肽数量较多，常见的合成同位素多肽法所需的时间与经济成本过高，本研究采用同位素二甲基衍生化法[26]对所研究的目标多肽进行同位素标记。针对同一种多肽，以其二甲基衍生化产物与同位素二甲基衍生化产物峰面积比值作为其相对峰面积，实现内标法检测。为确保所有候选多肽都能被完全衍生化，首先考察了各候选多肽的二甲基衍生化效率。在二甲基衍生化与同位素二甲基衍生化处理的样品中，均未发现未被衍生化的多肽，表明其衍生化效率高。同时，二甲基衍生化的多肽与同位素二甲基衍生化的多肽之间不存在干扰。

　　2.3.2特征多肽酶解水平与线性考察

　　在确定MRM参数以及二甲基衍生化效率之后，本研究考察了候选特征多肽在0～6h(0、0.5、1、2、3、4和6h)内的酶解水平，平行实验3次，比较了各多肽达到最大酶解程度所需的时间。如表2所示，奶牛奶、水牛奶、牦牛奶的10条候选多肽酶解程度均可在3h内达到最大，表明多肽酶解效率较高;但水牛奶多肽YNVPQLEIVPNLAEEQLHSMK等4条多肽(表2中标记*)在达到最大酶解水平后的几个小时内含量明显下降，表明其稳定性或抗基质干扰能力较弱。

　　奶牛、水牛和牦牛3个物种奶的候选多肽的线性结果。奶牛与牦牛奶的候选特征多肽均表现出良好的线性关系，其线性相关系数r2均大于0.994。在水牛奶的候选多肽中，多肽FQSEEQQQMEDELQDK与多肽FFNDK线性相关系数均低于0.95，多肽LSFNPTQLEEQCHV与SCQAQPTTMTR线性相关系数大于0.99，具有较好的线性关系。

　　依据实验结果，奶牛奶与牦牛奶中候选多肽符合酶解水平与线性考察的要求，因此确定候选多肽LSFNPTQLEEQCHI(奶牛)与LSFNPTQLEGQCHI(牦牛)即为其对应物种的特征多肽;而在水牛奶中，选择来自乳清蛋白的候选多肽LSFNPTQLEEQCHV(水牛)与来自酪蛋白的特征多肽SCQAQPTTMTRK(水牛)共同作为水牛奶特征多肽。此外，同时采用两条多肽可识别目标蛋白，以确定其来源于水牛酪蛋白，还是来源于水牛乳清蛋白，在婴儿配方粉等强化奶制品中可以实现乳清蛋白与酪蛋白的分别鉴定。同理，在其余5个物种奶中，共有9条多肽(除驴奶1条以外，其余物种奶均选择乳清蛋白与酪蛋白中特征多肽各1条)被最终选作对应的特征多肽。

　　2.4模拟混合样品的检测

　　为考察所筛选的13条特征多肽对各物种奶的分辨能力，采用上述方法对奶牛奶与其它7个物种奶的模拟混合样品进行了MRM检测，以奶牛奶标准曲线样品作为参考，分析各混合样品中奶牛奶特征多肽的含量，并计算出奶牛奶的混合比例。同理，以各物种奶标准曲线样品作为参考，获得对应混合样品中各物种奶的混合比例，并与理论值进行比较，结果见电子版文后支持信息表S11。通过各物种奶特征多肽计算的样品混合比例与理论混合比例基本一致，并且依据多肽计算的比例所绘制的浓度曲线线性相关系数均大于0.99，表明各物种奶特征多肽在与奶牛奶混合样品的鉴别过程中可保持良好的特异性。

　　3结论

　　本研究基于靶向蛋白质组学的分析原理，采用UHPLC-OrbitrapMS与UHPLC-TQMS，建立了奶牛、水牛、牦牛，山羊、绵羊，驴、马和骆驼8个不同物种奶的鉴别方法。利用二甲基衍生化实现对不同物种来源的多条多肽的分析比较，最终筛选出13条具有物种特异性的特征多肽，实现了对混合样品及实际奶制品中乳蛋白物种来源的鉴别。研究结果表明，特征多肽分析在多物种乳蛋白鉴别过程中不仅表现出良好的稳定性、特异性，同时还可满足高温灭菌乳或乳粉等加工奶制品的检测需求。本研究有望在奶制品行业的品质监管中发挥积极作用。

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　　作者：陈雨湉1任一平2王丽丽*1黄忠平*1