不同管理方式下秋季刺参养殖环境中菌群结构分析

　　摘要：017年11月(秋季)，在辽宁省大连市青堆子海域(N39.78°，E123.32°)的自然纳潮、微孔曝气和养水机调水种管理方式的矩形海参(Apostichopusjaponicus)养殖池塘中，按照《国家海洋调查规范》(GB/T12763)规定的方法采集水样和泥样，用高通量测序技术研究了秋季不同水质调控方式下刺参养殖池塘水体和底泥中菌群群落结构特征。试验池塘面积为5.1ha，南深北浅，泥沙池底，实验期间各池塘不投饵和药。结果显示：三种池塘的底泥菌群多样性要高于水体中;养水机池塘水体中的菌群多样性高于其他两种池塘，微孔曝气池塘底泥中菌群多样性最高。水样和泥样中第一优势菌门都是变形菌门(Proteobacteria);次优势菌门有所不同，养水机、微孔曝气和自然纳潮池塘中，水样和泥样分别为：厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿湾菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)。三种池塘内优势菌群群落构成相同，但其各自门、纲和属的相对丰度有所不同。本结果为选择刺参养殖池塘的水质管理方式提供了一定理论依据。

　　关键词：刺参;管理方式;高通量测序;菌群结构

　　刺参(Apostichopusjaponicus)营养和经济价值较高，已经成为辽宁和山东等地的重要养殖对象之一[13]。2018年全国海参产量约1.74万，养殖面积达到2.38万ha[4]。刺参多以池塘养殖为主。为打破制约刺参养殖业发展的瓶颈，近年来大力推广微孔曝气装置，辅助调控水质取得了很好的效果。如快速增氧和去除底泥中有机质等，但在使用过程中存在易堵塞和维护费用高的缺点[56]。本研究团队研发了养水机辅助水质调控设备，在实际调控水质中较于前两种方式具一定优势[79]。

　　在生产中，可通过换水和水质调控设备辅助保持较好养殖水质，但环境中微生物在养殖池塘中物质循环和能量流动、改善水质环境以及刺参健康中起到了关键作用[10]。如假交替单胞菌Pseudoalteromonasnigrifaciens、假单胞菌Pseudoalteromonas和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)等都可使刺参患病[1113]。而枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和乳酸菌(Lacticacidbacteria,LAB)等，对养殖环境水质的改善、提高养殖生物的非特异性免疫酶活性以及促进养殖生物生长等都有明显的作用[1416]。秋季是刺参重要的生长期，养殖环境的变化会对刺参的生长有一定的影响。

　　因此，对秋季刺参养殖池塘环境中菌群结构的研究具有重要的意义。 传统的细菌培养方法存在一定局限性，无法满足细菌群落结构研究的需要[1718]。近年来，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术发展，是研究环境中菌群结构的重要手段[1920]。目前对刺参池塘养殖中菌群结构的研究，多利用DGGE指纹图谱技术[2122]，其存在反应优势菌信息少和操作繁琐等问题。而利用16SrDNA高通量技术研究刺参养殖池塘的菌群结构，则应用优势明显[10]。所以本研究利用该技术研究了自然纳潮、微孔曝气和养水机种水质管理方式下，参池环境中菌群结构，为参池管理方式的选择提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　试验在大连市青堆子海域(N39.78°,E123.32°)的自然纳潮、微孔曝气和养水机池塘种海参养殖池中进行。试验池均为矩形，面积都为5.1ha，池塘内南深北浅，泥沙池底。实验期间各池塘不投饵和药，统一管理。养水机是本研究团队自主研发的新型水质调控装置(专利号：ZL200610077526.5)见图。其工作原理是通过进水管道把池塘表层溶氧量相对较高的水引入到底层动力泵，通过动力泵把表层高溶氧量的水射入底层水体中，实现表底层水体强制交换，使得养殖池塘水体的流动加快，并增加底层水体的溶氧量。

　　此外，水体的强制交换过程有利于养殖池塘水体表底层的混合均匀，对于养殖池塘水体会出现的温度和盐度的分层具有一定的破坏作用，可以降低因水体分层造成养殖池塘底层水体缺氧现象的发生。养水机位于池塘进水口最低处，水泵功率750W，喷头出水量为12m/h，每天21:00—次日9:00工作12h。微孔曝气主要由供气装置、气体传输管道和微孔曝气管三部分组成。其工作原理是将空气压缩后通过安装在池底的曝气管，以微气泡的形式向水中扩散。微孔曝气设备在池塘水体缺氧时开启，如阴雨天和夏季高温期适当增加开机时间。

　　1.2方法

　　1.2.1样品采集2017年11月按照《国家海洋调查规范》(GB/T12763)的方法采集三种实验池塘水样和泥样，样品标记信息见表。样品立即放入80℃液氮冷冻后，再用干冰冷冻运送到北京诺禾致源科技股份有限公司测定。具体的样品采集步骤见参考文献郭超等23]。每个样品采集点采集两个平行样品。

　　1.2.2样品DNA提取、PCR扩增和测序用CTAB法提取样本DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA，确保取得样品DNA的完整性。条带清晰完整无拖尾则视为采集的样品质量合格。使用NanoPhotometer®ClassicLaunched(IMPLEN,GER)测定其纯度，提取成功样品的DNA保存于20℃下备用。应用含有Illumina接头和barcode序列的引物341F806R(MichelsenCF)，扩增样品中DNA的16SrRNA基因的V3~V4可变区。最后应用IlluminaMiseq测序平台完成序列测序。

　　1.2.3数据处理及生物信息学分析首先，处理获得的原始序列，保留有效序列。接着使用FLASH和QIIME[2425]软件将序列拼接为tags，然后对tags进行聚类。根据Greengenes数据库进行分类学注释。最后，计算各个样品的细菌群落相对丰度。应用PAST软件[24]计算个样品中的细菌群落的α多样性。

　　2结果与分析

　　2.1细菌群落分类学注释

　　个样品中总tags平均值为81111，可分类的tags平均值为70794，无法分类的tags平均值为，非沉余tags平均值为10315，运算分类单元平均值为926。在养水机池塘水体和底泥中分别检测出47个门、100个纲、448个属和56个门、107个纲、362个属的细菌。微孔曝气池塘水体和底泥中分别检测出44个门、127个纲、386个属和60个门、128个纲、450个属的细菌。自然纳潮池塘水体和底泥中分别检测出44个门、98个纲、398个属和55个门、107个纲、440个属的细菌。

　　2.2细菌群落结构分析

　　在门水平上，三种池塘个样品中相对丰富度占比前10的门分别为：变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinocteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)。

　　其占比为92.96~99.05%。三种池塘底泥和水体中的绝对优势菌门都是变形菌门，相对丰富度占55.86%70.86。在纲水平上，个样品中相对丰富度占比前10的纲占比67.22~92.76%。三种池塘底泥和水体中的绝对优势菌门都是变形菌门，相对丰富度占比55.86~70.86。在水样中三种池塘的Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria都是占比前两位的优势菌纲，相对丰度占比42.13~63.45%。

　　三种池塘的底泥样品中Gammaproteobacteria和Deltaproteobacteria都是占比前两位的优势菌纲，相对丰度占38.54~50.56%。在属水平上，个样品中相对丰富度占比前30的属占比15.16%~47.04%。在个样品中各自的第一优势菌属有所不同，养水机池塘水样中未确(unidentified)的Chloroplast(相对丰度为7.37%)，微孔曝气和自然纳潮池塘是Lentibacter(相对丰度为13.17%和7.70%)。养水机池塘底泥样品中是Desulfobulbus(相对丰度分别为1.94%)，微孔曝气和自然纳潮池塘是Sulfurovum(相对丰度分别为5.84%和4.88%)。

　　2.3菌群多样性

　　2.3.1α-多样性分析个样品的文库覆盖率均大于0.970，说明本试验数据具有较高的可信度。三种不同池塘底泥和水体样本细菌群落的α多样性指数值见表。由表可知，养水机池塘水样中Chao、ACE、Shannon和Simpson指数最高。微孔曝气池塘水样的Chao、ACE、Shannon和Simpson指数最低。

　　养水机池塘泥样中Chao和ACE指数最低。自然纳潮池塘的Shannon指数最低。微孔曝气池塘的Chao、ACE和Shannon指数都最高，而Simpson指数最低。三种池塘的Simpson指数一致。 随着随机抽取的序列总数的增加，Chao1、observedspecies和Shannon曲线图，各个样品的三种曲线到达60000这个临界值时都趋于平缓，表示测序结果已经可以反映当前样品所包含的多样性。继续增加测序深度已不能检测到数量较多且尚未发现的新类型OUT。

　　3讨论

　　3.1不同水质调控方式下参池环境中菌群多样性

　　Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数可用于评价细菌群落多样性、物种丰富度和均匀度。根据保险假说(Insurancehypothesis)，高生物多样性有利于提高生态系统的稳定性[27]。表中三种池塘的Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数都是底泥中高于水中，这与闫法军等[28]和Zhao等[29]的研究结果一致。这是因为海洋沉积物表层环境微生物量约占到海洋微生物总量的70%[30]。

　　三种池塘水环境中，养水机池塘的Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数均最高，微孔曝气池塘最低。这是因为养水机池塘长时间的水体循环，使得池塘内各水层间的浮游植物量和菌群分布相较于其它两个池塘更为均匀[31,32]。浮游植物光合作用产生的有机质会促进细菌的大量繁殖[31]。其次，养水机长时间的工作使水体扰动，底泥中的细菌随着再悬浮颗粒进入水体。养水机池塘水中样品离底泥样品比其它两种池塘更近，可能与这个原因有关。

　　虽然，微孔曝气池塘同样会造成水体扰动，但其在实际生产使用主要是为了快速给池塘增氧，开机时间相对较短，不会产生像养水机池塘那样明显的效果。高溶氧量会抑制厌氧细菌[10]。但三种池塘底泥中的结果反之。有研究表明，有机物含量对环境中菌群的多样性和丰度有正相关关系[30,3436]。因此，养水机池塘水环境中菌群多样性最高。这对于水体较浅易受外界环境影响的刺参池塘，有利于养殖水体环境的稳定，可以一定程度抑制病原菌的大量繁殖，有利于刺参的存活。

　　3.2不同水质调控方式参池环境中菌群特征

　　近年来，对刺参池塘环境中菌群群落组成已有报道。谭八梅等[37]、丁斯予等[38]和Zhao等[29]研究发现，秋季刺养殖池塘水体和底泥中，第一和第二优势菌门均为变形菌门和拟杆菌门，前者为绝对优势菌门。这与本研究的种刺参养殖池塘的水体和底泥中菌群组成结果相似，其中，三种池塘的第一优势菌门一致，为变形菌门(相对丰度为55.86%以上)。在刺参养水机池塘水体的第二优势菌门为厚壁菌门，其他两种池塘都为拟杆菌门。这可能是因为水温的降低使得养水机池塘水体中厚壁菌门相对丰度变大[36]。

　　微生物在分解底泥中有机质时释放热量会使间隙水水温升高.5℃[39,40]。夜间养水机设备工作时，将表层的低温水与底层高温水交换，使得池塘内底层水体温度加速下降。而芽孢杆菌纲内的物种具有较强的环境适应性[41]。因此养水机池塘内第二优势菌门有别于其它两种池塘。董春光等[14]发现，厚壁菌门的枯草芽孢杆菌对养殖水体中的NO和NO有一定的去除作用，提升养殖水质的同时促进了刺参的生长。养水机池塘水体环境在一定程度上要优于其他两种池塘。

　　在养水机、微孔曝气和自然纳潮种水质调控方式下刺参养殖池塘底泥中，第二优势菌门分别为拟杆菌门、绿湾菌门和厚壁菌门。养水机池塘和微孔曝气池塘与其他人的研究结果不一致，可能是因为增加水体溶氧量时对水体产生扰动有关。姚丽平[42]研究发现，不同曝气强度影响底泥中细菌结构分布和其在物质循环过程中的作用。如流速为0.247m/s、对应溶氧为6.18mg/L、雷诺数为1311的曝气条件下，以厚壁菌门和变形菌门为优势菌群，且对硫酸盐还原菌生长有促进作用。

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　　自然纳潮池塘厚壁菌门中的芽孢杆菌纲(Bacilli)和梭菌纲(Clostridia)为主要优势菌纲，其相对丰度分别为：7.07%和3.83%。孙永旭等[43]研究发现，缺氧组花鲈(Lateolabraxmaculatus)肠道菌群变形菌门相对丰度显著下降，而梭菌纲和拟杆菌纲明显上升。自然纳潮池塘相较于其他两种池塘，细菌丰度变化趋势与缺氧组花鲈肠道菌群丰度一致。说明自然纳潮池塘的溶氧要低于其他两种池塘。三种池塘中优势菌门、纲和属是一致的，其差异主要表现在各优势菌门的相对丰度有所不同。这可能是养殖池塘内环境不同所致[44,45]。说明刺参养殖池塘管理方式的不同，不能改变养殖环境中优势菌群结构，但可以改变优势菌群的相对丰度。

　　参考文献：

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　　[2]YangH,HamelJF,MercierA.TheSeaCucumberApostichopusjaponicus[M].Elsevier/AP,2015.

　　[3]费聿涛.刺参养殖环境微生物和理化因子与刺参病害发生关系的研究[D].上海：上海海洋大学，2016.

　　[4]农业农村部渔业渔政管理局中国渔业统计年鉴[M].北京：中国农业出版社，2019.

　　[5]徐皓，田昌凤，刘兴国，等养殖池塘增氧机制与装备性能比较研究[J].渔业现代化，2017，44：8.

　　[6]顾海涛，刘兴国，何雅萍，等微孔曝气式增氧机的性能及应用效果[J].渔业现代化，2017，44：2528.

　　[7]王祖峰.仿刺参养殖池塘三种水质控制技术效果的比较[D].大连：大连海洋大学，2016.

　　作者：王玉龙，林青，孙亚慧，王文琳，张津源，周玮