微生物复合发酵沙蟹汁的制备工艺优化及其风味研究

　　摘要研究了微生物复合发酵沙蟹汁的制备工艺，并比较了传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁的风味成分。选择植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和鲁氏酵母菌(Saccharomycesrouxii)作为外加复合发酵菌种，以感官评分和氨基态氮含量为指标，通过单因素试验和响应面分析法优化微生物复合发酵沙蟹汁的制备工艺，并采用感官评价和理化指标对传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁的风味成分进行分析。结果表明:植物乳杆菌和鲁氏酵母菌的最佳混合浓度比例为3∶2，发酵时间17d，发酵温度26℃，发酵剂接种量5%，发酵初始pH值7.5，在此条件下沙蟹汁感官评分为7.38。相比于传统沙蟹汁，复合发酵沙蟹汁的游离氨基酸总量和鲜甜味氨基酸含量分别为2605.77和783.68mg/100g，分别增加了16.12%和22.40%;有机酸总量为665.19mg/100g(增加了13.54%)，其中乳酸和琥珀酸含量分别为221.27mg/100g(增加了27.74%)和176.24mg/100g(增加了57.28%);呈味核苷酸含量变化较小，其中IMP和ADP含量略有增加;感官评分和氨基态氮含量分别增加17.31%和22.62%，同时挥发性盐基氮含量降低了28.69%。综上，微生物复合发酵法能显著提高传统沙蟹汁的风味品质，这对于沙蟹汁的工业化生产和风味改良有重要的理论意义和实际意义。

　　关键词沙蟹汁;风味改良;微生物复合发酵法;鲁氏酵母菌;木糖葡萄球菌

　　沙蟹汁是广西北海特有的传统美食，具有风味独特、口味鲜美等特点，常用来制作“沙蟹汁焖豆角”、“沙蟹汁蘸白切鸡”等当地特色名菜，深受人们的喜爱[1-2]。传统沙蟹汁是以海滩野生沙蟹为原料，清洗后去除内脏和污物，捣碎后混以一定比例的食盐放入发酵罐中，经过1个月左右的自然发酵后制得[3]。目前沙蟹汁的生产以传统方法为主，其产品存在腥异味重的问题，严重阻碍了产品的推广。

　　微生物论文范例： 微生物采油技术在石油开采中的应用研究

　　微生物发酵法是食品工业中常用风味改良方法之一，可以通过微生物作用将小分子腥味物质转变为无腥味的物质，同时还能产生特殊的发酵香味，从而达到“除臭增香”的目的[4]。目前食品行业多采用多种菌种复合发酵的方式，不仅可以弥补单一菌种发酵的缺陷，而且能缩短发酵时间[5-6]。解万翠等[7]在虾头酱中添加3种菌株(植物乳杆菌、黑曲霉和季氏毕赤氏酵母)进行混合发酵，大大提高了发酵效率，并增加了虾酱的风味。张晶等[8]采用复合菌和安琪酵母发酵野生猕猴桃果酒，显著提高了产品的香气品 质，且口感更加醇厚。

　　TURCHI等[9]使用2种混合菌株(植物乳杆菌和嗜热链球菌)对驴奶进行发酵，发现混合菌种的发酵产品整体品质要优于单一菌株。BERTUZZI等[10]采用协同发酵法(汉逊德巴利酵母、腐生葡萄球菌和干酪棒状杆菌)制备奶酪，发现奶酪色泽和品质发生明显改变。目前，采用复合发酵法制备沙蟹汁的研究尚未见报道。植物乳杆菌是一种广泛存在于发酵食品中的微生物，对肉类风味形成有积极的促进作用[11]。鲁氏酵母菌是发酵食品行业中常用的增香型菌株，在发酵过程中会产生大量糖类物质，并伴随产生呋喃酮、芳香醇、高级醇等化合物，能显著提升产品的香气[12]。

　　本文以沙蟹为原料，在传统工艺的基础上添加鲁氏酵母菌和植物乳杆菌进行发酵，以感官评分和氨基态氮含量为指标，采用单因素试验结合响应面分析法优化复合发酵沙蟹汁的制备工艺，并比较复合发酵沙蟹汁与传统沙蟹汁的风味成分，以期为沙蟹汁的风味改良提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料与仪器

　　沙蟹，北海市回头客食品有限公司;生姜、食盐均为市售;IMP、GMP、ATP、ADP、AMP、HxR、Hx标准品(纯度≥99.0%)，美国Sigma公司;植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，菌种编号GIMI.191)和鲁氏酵母菌(Saccharomycesrouxii，菌种编号AS2.180)，中国科学院菌种保藏中心;YPD液体培养基、MRS液体培养基，青岛海博生物技术有限公司;ADP、HxR、Hx、GMP、AMP、ATP、IMP标准品，上海源叶生物科技有限公司;有机酸和氨基酸标准品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

　　MJ-160型恒温培养箱，上海跃进医疗器械有限公司;L-P1200型粉碎机，郑州力威设备有限公司;L8900型氨基酸分析仪、LC-10AT型高效液相色谱仪，日本Shimadzu公司;LDZX-50KB型高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂;FE28-Stan型酸度计，梅特勒托利多仪器有限公司;MR-23i型冷冻离心机，法国Jouan公司。

　　1.2实验方法

　　1.2.1沙蟹汁的制备

　　传统沙蟹汁:取处理好的沙蟹1kg、生姜末200g和食盐300g，搅拌均匀后加入500g凉白开，然后使用均质机以8000r/min的条件均质3min。均质好的混合溶液(pH7.5～8.0)装入干净的发酵罐，晾晒发酵15d(日晒夜露，25℃左右)，所得产品即为传统沙蟹汁。发酵结束后将沙蟹汁混合均匀，并于4500r/min条件下离心15min，取上清液保存于-20℃备用。复合发酵沙蟹汁:按上述相同方法均质，均质好的混合溶液调节pH值，加入一定量的复合发酵剂，混合均匀后置于恒温培养箱静置发酵，所得产品为复合发酵沙蟹汁。发酵结束后将沙蟹汁混合均匀，于4500r/min条件下离心15min，取上清液保存于-20℃备用。

　　1.2.2菌悬液的制备

　　参考李锐等[12]的方法，稍作改动。将植物乳杆菌和鲁氏酵母菌分别接种到MRS液体培养基和YPD液体培养基中。植物乳杆菌于37℃恒温培养箱振荡培养22h，连续传代2～3次至活力恢复。鲁氏酵母菌于30℃恒温培养箱振荡培养40h，连续传代2～3次至活力恢复。培养结束后，菌悬液离心(4℃，4000r/min，时间15min)，收集菌体沉淀并溶于灭菌生理盐水(0.85%)，最终调整菌悬液菌落个数为108CFU/g。1.2.3复合发酵法改良沙蟹汁的单因素试验微生物复合发酵法改良沙蟹汁的固定条件为:植物乳杆菌和鲁氏酵母菌混合比例3∶2，发酵时间17d，发酵温度26℃，复合发酵剂接种量5%(以混合溶液总质量为计)，发酵初始pH7.5。

　　固定其他条件不变，改变其中某个因素条件分别分析对复合发酵沙蟹汁感官评价及氨基态氮含量的影响。设置各因素的梯度分别为:植物乳杆菌和鲁氏酵母菌混合比例0∶3、1∶3、2∶3、1∶1、3∶2、3∶1、3∶0，发酵时间13、15、17、19、21、23、25d，发酵温度20、22、24、26、28、30、32℃，复合发酵剂接种量1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，发酵初始pH值6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。发酵结束后灭菌，冷却后样品备用。

　　1.2.4响应面分析法优化复合发酵法改良沙蟹汁的最佳工艺根据单因素实验确定发酵温度、发酵时间和发酵剂接种量3个因素为自变量，以感官评分为响应值，采用响应面分析法优化复合发酵法改良沙蟹汁的最佳工艺条件。

　　1.2.5感官评价

　　参考边昊等[13]的方法，通过感官描述法对沙蟹汁的感官属性进行分析。挑选10名感官评价员(6名女性和4名男性，年龄19～30岁)，所有的评价人员均在食品感官分析领域有着丰富的经验，并熟悉各种感官描述词汇。感官评价前，将样品置于50℃水浴锅中恒温加热10min，并分别装入5个同样的容器，评价时随机取样。根据感官评定标准，评价人员对沙蟹汁的色泽、香气、滋味和形态进行打分，最后取10位评价人员的平均值作为最终评分。

　　1.2.6其他理化指标的测定

　　氨基态氮含量的测定参考王雪锋等[14]的方法;挥发性盐基氮(totalvolatilebasicnitragen，TVB-N)的测定参考吴燕燕等[15]的方法。

　　游离氨基酸含量的测定参考宓月光等[16]的方法，稍有改动。取沙蟹汁1.0g，加入3mL质量浓度为50g/L磺基水杨酸溶液，混合均匀后静置1h，于9000r/min条件下离心15min，取上清液并使用水系微孔滤膜过滤(0.22μm)，然后用L8900型氨基酸分析仪进行测定。有机酸含量测定依据段珍珍等[17]的方法，稍有改动。取沙蟹汁5.0g，加25mL超纯水混合均匀，然后使用均质机以10000r/min的条件均质10min，于7000r/min条件下离心10min，取上清液用超纯水准确定容至50mL。样品液使用水系微孔滤膜过滤(0.22μm)，用高效液相色谱仪进行分析。

　　呈味核苷酸含量的测定参考YANG等[18]的方法，稍有改动。取沙蟹汁5.0g，加入30mL质量浓度 为0.05g/mL的高氯酸溶液，使用均质机以10000r/min的条件均质10min，于7000r/min条件下离心10min。取沉淀加入10mL质量浓度为0.05g/mL的高氯酸溶液再次提取，重复操作2次，合并两次离心后的上清液，使用浓度为5mol/L的KOH溶液调节pH为6.75，用超纯水准确定容至50mL。样品液用水系微孔滤膜过滤(0.22μm)，使用高效液相色谱仪进行分析。

　　1.3数据处理

　　每个数据设置3个重复，结果用平均值±标准偏差表示，使用Design-Expert8.0.6、IBMSPSS22.0和Origin8.0软件进行作图和数据分析。

　　2结果与讨论

　　2.1复合发酵改良沙蟹汁的单因素试验

　　以感官评分和氨基态氮含量为指标，植物乳杆菌和鲁氏酵母菌混合比例、发酵时间、接种量、发酵温度和发酵初始pH值5个单因素试验结果。

　　不同混合比例对沙蟹汁的感官评分和氨基态氮含量有较大影响。在所有混合比例中，菌种混合比例3∶2时沙蟹汁的感官评分最高，为6.94;菌种混合比例1∶3时沙蟹汁的氨基态氮含量最高，为(5.31±0.07)mg/mL，其次为菌种混合比例3∶2，氨基态氮含量为(5.25±0.13)mg/mL，两者之间没有显著性差异(p<0.05)。综合考虑，选择植物乳杆菌和鲁氏酵母菌混合比例为3∶2。

　　随着发酵时间的延长，沙蟹汁的感官评分逐渐增加，于发酵17d时感官评分达到最大值7.85，此时氨基态氮含量为(5.33±0.07)mg/mL，说明此时沙蟹汁发酵风味已趋于成熟。发酵17d后沙蟹汁的感官评分和氨基态氮含量缓慢下降，这可能是由于在发酵后期，菌种产生有机酸、乙醇等次级代谢产物，使得沙蟹汁风味劣化[13]。

　　因此，选择发酵17d较为合适。随着接种量的增加，沙蟹汁的感官评分呈先上升后下降的趋势，并于接种量为5%时感官评分达到最大值7.44，此时氨基态氮含量为(5.33±0.07)mg/mL。继续增加接种量，沙蟹汁的感官评分开始下降。有研究表明，发酵液中酵母菌过多会产生酵母味、酸味和酒精味，导致香气品质下降[19]。因此，选择接种量5%较为合适。

　　2.3传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁风味比较

　　2.3.1游离氨基酸含量

　　游离氨基酸是沙蟹汁鲜美滋味的主要来源，也是判断产品质量的重要标准之一。传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁中游离氨基酸含量。传统沙蟹汁中游离氨基酸总量为2244.12mg/100g，鲜甜味氨基酸含量为640.26mg/100g，占总量的19.08%。复合发酵沙蟹汁中游离氨基酸总量和鲜甜味氨基酸含量分别为2605.77和783.68mg/100g，相比传统沙蟹汁，分别增加了16.12%和22.40%;在所有氨基酸中，精氨酸、天冬氨酸、组氨酸和赖氨酸含量较高，为1503.11mg/100g，此4种氨基酸占游离氨基酸总量的57.69%，对复合发酵沙蟹汁的滋味形成有重要贡献。

　　徐高丹等[20]报道发酵酱油中添加酵母菌，氨基酸的种类和含量会更加丰富，产品的感官评分和风味更好。李锐等[12]报道了克氏原螯虾头酱中添加复合发酵剂(木糖葡萄球菌、戊糖片球菌和鲁氏酵母菌)后，游离氨基酸含量明显增加，产品风味更加醇厚。综上，复合发酵沙蟹汁中鲜甜味氨基酸含量和游离氨基酸总量有显著高于传统沙蟹汁，产品滋味有较大的改善。

　　2.3.2有机酸含量

　　传统沙蟹汁和复合发酵沙蟹汁中有机酸含量的变化。传统沙蟹汁中有机酸含量最高为乙酸(246.28mg/100g)，其次为乳酸(173.22mg/100g)、琥珀酸(112.05mg/100g)，含量最低为苹果酸(21.13mg/100g)。相比传统沙蟹汁，复合发酵沙蟹汁中有机酸总量为665.19mg/100g(增加了13.54%)，其中苹果酸、柠檬酸和乙酸含量分别降低了26.69%、14.28%和9.15%，而乳酸和琥珀酸含量显著增加，为221.27mg/100g(增加了27.74%)和176.24mg/100g(增加了57.28%)。

　　琥珀酸和乳酸是水产品中对呈味有重要贡献的2种有机酸，特别是琥珀酸及其钠盐。琥珀酸具有清爽的酸味和鲜味，与鲜味氨基酸有协同作用，赋予产品可口的味觉和醇厚感[21]。有研究指出，丙酮酸脱水还原可形成琥珀酸，另外部分氨基酸在微生物作用下脱去氨基也可形成琥珀酸;部分乳酸可能来自于水产品本身，大多数则来自于发酵过程[22]。

　　3结论

　　本研究首次采用微生物复合发酵法改良传统沙蟹汁的制备工艺，在传统工艺的基础上添加鲁氏酵母菌和植物乳杆菌进行发酵，植物乳杆菌和鲁氏酵母菌的最佳混合浓度比例为3∶2，通过单因素试验结合响应面法确定了最佳工艺条件:发酵初始pH值7.5，发酵时间17d，发酵温度26℃，发酵剂接种量5%，在此条件下沙蟹汁感官评分为7.38。相比于传统沙蟹汁，复合发酵沙蟹汁的腥异味明显降低，产品色泽清亮、香气纯正、滋味醇厚，其感官评分、氨基态氮含量、游离氨基酸总量、鲜甜味氨基酸含量和有机酸总量有不同程度增加，同时TVB-N含量显著下降，这说明微生物复合发酵法能显著提高沙蟹汁的风味品质。本研究为沙蟹汁的规模化生产和风味改良提供理论基础，且对于沙蟹汁的市场推广具有重要的实际意义。

　　参考文献

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　　作者：边昊1，陈柏宇2，李锐3*