茶树TPS基因家族的鉴定及表达

　　摘要铁观音是高香茶树品种的选育亲本骨干，具有品种独特的“观音韵”，其鲜叶加工成乌龙茶，香气馥郁持久;萜类合成酶(TPS)是茶树萜类化合物合成过程中的关键酶，在茶叶香气的形成中起到关键作用。为探究茶树TPS基因家族的潜在功能，利用生物信息学方法及荧光定量PCR技术，对茶树TPS基因家族进行了鉴定及表达分析。生物信息学分析结果表明，从茶树铁观音基因组中鉴定出48条TPS基因，分别命名为CsTPS1-CsTPS48，均含有N末端结构域和C端金属离子结合结构域。系统进化树显示，CsTPS基因家族分为5个亚家族，为TPS-a、TPS-b、TPS-g、TPS-c和TPS-e/f。相同亚家族的CsTPS基因外显子-内含子数目基本一致。上游启动子区域分析发现大量与植物发育、激素和胁迫响应相关的顺式作用元件。转录组数据分析表明，CsTPS基因在茶树特定发育时期发挥重要作用。荧光定量检测发现，CsTPS3、CsTPS23、CsTPS25、CsTPS29和CsTPS30在MeJA处理下的表达量显著上调;CsTPS3在GA处理下的表达量显著上调;CsTPS29和CsTPS30在低温和干旱处理下表达量显著上升。综上所述，CsTPS基因在茶叶香气的形成中发挥重要作用，并且与茶树生长发育、激素和胁迫响应紧密相关;结果可为进一步探究茶树TPS基因家族的功能及在茶叶香气形成中的作用提供参考。

　　关键词茶树;萜类合成酶;系统进化;胁迫;表达分析

　　萜类化合物是植物重要的次生代谢物，具有挥发性和芳香味，赋予植物特殊的香气。同时对传粉、植物防御、调节植物生长发育等方面产生重要影响[1]。次生代谢物中的萜类化合物有倍半萜(sesquiterpenes，C15)、单萜(monoterpenes，C10)、二萜(diterpenes，C20)、三萜(triterpenes，C30)等。萜类合成酶(terpenesynthase,TPS)在植物萜类物质合成的关键酶。TPS家族系统分为7个亚家族，分别为TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g和TPS-h，其中TPS-a主要合成倍半萜合酶，TPS-b和TPS-g主要合成单萜合酶，TPS-c和TPS-e/f主要合成二萜合酶[2]。

　　此外，Pfam(http://pfam.xfam.org/)数据库显示，TPS有两个保守域，分别为N末端结构域(PF01397)和C端金属离子结合结构域(PF03936)[3]。TPS还具有RRX8W、RXR、DDXXD、NSE/DTE基序等保守的结构特征。萜烯类代谢途径与茶叶香气形成密切相关[4]。特别是挥发性单萜和倍半萜，单萜中的香叶醇(玫瑰花香)和芳樟醇(木清香和花香)等，以及倍半萜中的橙花叔醇(橙花香)和α-法尼稀(花香)等，在茶叶香气组分中占据重要地位[5]。

　　目前，课题组已对茶树萜烯类代谢途径中的相关基因进行了克隆或鉴定等相关研究，如二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(CsMVD)、甲羟戊酸激酶基因(CsMVK)、单萜合成酶(CsTPS)和萜类合成相关基因[6-9]。近些年来，TPS基因已在多个物种得到鉴定，如拟南芥、番茄、烟草、中粒咖啡、水稻、葡萄、茶树等[10-16]。铁观音(Camelliasinensis„Tie-guanyin‟)因其制茶品质优异，已成为高香茶树品种尤其是乌龙茶品种的选育亲本骨干，铁观音制作的乌龙茶，冲泡后具有天然的兰花香，香气馥郁持久，滋味醇厚而甘甜，具有品种独特的“观音韵”。前人通过茶树转录组数据鉴定出80个CsTPS基因，并参与激素和非生物胁迫应答[16]。但有关茶树品种铁观音TPS基因家族的鉴定及表达分析还未见报道。

　　因此，本研究在全基因组水平对茶树TPS基因家族进行鉴定，利用生物信息学分析CsTPS基因家族及其在6个组织中的表达模式。通过荧光定量PCR检测研究CsTPS基因家族在MeJA、GA、低温和干旱处理过程下的表达模式，以期为探究茶树TPS基因家族的功能及在香气形成中的作用提供参考。

　　1材料与方法

　　1.1材料处理以国家级优良茶树品种„铁观音‟为试验材料，将环境温度下的茶树分别进行低温(4℃)和干旱(10%PEG-6000溶液)处理。用新鲜配制的100μmol/LMeJA、GA溶液进行激素处理。收集MeJA、GA激素处理0(对照)、6、12、24、48h和4℃、PEG处理0(对照)、24、48h后的第二叶。每个设置3次生物学重复，锡箔纸包裹标记，液氮固样后保存于–80℃冰箱备用。

　　1.2茶树TPS基因家族成员的鉴定从茶树铁观音基因组数据库中下载蛋白序列，在Pfam(http://pfam.xfam.org/)数据库中下载PF01397和PF03936的隐马尔可夫模型，利用HMMER软件搜索茶树TPS基因家族的候选序列，去除掉只含有一个结构域的基因，得到同时含PF01397和PF03936这两个结构域的基因序列，并在CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和SMARAT(http://smart.embl-heidelberg.de)网站进行结构域验证，去除不完整的序列，得到具有全长蛋白序列的TPS家族成员序列。利用ExPASy(http://www.expasy.org)网站对茶树TPS蛋白的理化性质进行分析。利用WOLFPSORT(https://wolfpsort.hgc.jp)网站进行亚细胞定位预测。

　　1.3茶树TPS基因家族系统进化树构建和基因结构分析整理拟南芥[10]和番茄[11]中已鉴定出的TPS基因序列，从NCBI蛋白数据库下载对应TPS序列，用软件MEGA软件构建系统进化树，校验参数Bootstrap值设置为1000。在GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)网站分析茶树TPS基因结构[17]。

　　茶树TPS基因家族序列比对和保守基序分析用WebLogo(https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)网站和DNAMAN软件对CsTPS基因家族的保守序列进行分析。利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)网址预测保守基序，设置基序最大数目为15。使用TBtools软件[18]可视化茶树TPS基因在染色体上的位置。

　　茶树TPS基因启动子顺式元件分析用TBtools软件提取CsTPS基因转录起始位点上游2000bp的序列，利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)网站进行顺式元件预测分析[19]。

　　茶树TPS基因组织特异性表达分析下载铁观音茶树的转录组数据，参照前人方法计算获得CsTPS基因在芽、幼叶、老叶、茎和根的FPKM值[20]，使用TBtools软件[18]制作热图。

　　实时荧光定量PCR分析通过Primer3plus(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)网站设计荧光定量引物。以CsGAPDH作为内参基因。参照前人方法合成cDNA作为实时荧光定量PCR模板[21]。荧光定量PCR仪进行qRT-PCR反应：94℃30s;94℃5s，60℃30s，40个循环，反应体系使用Transstart®TipGreenqPCRsuperMix试剂盒的方法。用2-ΔΔCt算法计算基因相对表达水平[22]，用prism软件统计基因表达水平，用SPSS软件进行显著性分析。

　　2结果与分析

　　2.1茶树TPS基因家族的鉴定与序列分析通过鉴定最终得到48条TPS基因家族成员序列，并按照所在染色体位置分别命名为CsTPS1到CsTPS48。CsTPS基因编码序列为1002-2664bp，编码氨基酸数目为333-887。CsTPS家族的分子量在38.93-102.19kDa，等电点为4.6-6.66，CsTPS蛋白的等电点小于7，表明该家族基因为酸性蛋白。CsTPS均为亲水性蛋白。亚细胞定位发现大部分CsTPS定位于细胞质(25个)和叶绿体(17个)，5个CsTPS定位于细胞核，其中仅1个CsTPS定位于线粒体。

　　2.2CsTPS基因家族系统发育和基因结构分析

　　构建茶树与拟南芥及番茄的系统进化树。分析结果表明，CsTPS分为5个亚家族，其中TPS-a有16个成员，TPS-b有19个成员，TPS-g、TPS-e/f和TPS-c分别有6、5和2个成员。TPS-a和TPS-b这两个亚家族较大，包含了72.9%的CsTPS成员。这与只用CsTPS构建的进化树的分类结果一致。

　　CsTPS基因家族的基因结构图显示，CsTPS5基因组序列最长，超过37000bp。TPS-a亚家族所含外显子数目除CsTPS2(12个)、CsTPS1(4个)和CsTPS16(4个)外，CsTPS基因所含外显子数目为6-9个;TPS-b亚家族外显子数目为6-8个;TPS-e/f亚家族所含外显子较多有11-13个;TPS-c亚家族中的CsTPS18和CsTPS40分别有6和15个外显子，差异较大;TPS-g亚家族外显子数目为7-9个。可以看出，相同亚家族的CsTPS基因通常外显子-内含子结构也相似。

　　2.3CsTPS家族基因功能预测用NCBI的BLASTP将CsTPS蛋白序列与已知功能植物的萜类合成酶蛋白序列进行比较(E 90)，预测CsTPS基因可能存在的功能。其中，单萜合成酶：2个芳樟醇合成酶;倍半萜合成酶：10个大根香叶烯合成酶，8个α-法尼烯合成酶，2个橙花叔醇合成酶;双功能萜类合成酶：3个芳樟醇/橙花叔醇合成酶;二萜合成酶：3个香叶基芳樟醇合成酶，1个贝壳杉烯合成酶，1个柯巴基焦磷酸合酶。可以看出，CsTPS基因主要编码合成倍半萜合成酶。

　　2.4CsTPS家族染色体定位对茶树TPS基因染色体进行定位分析发现，CsTPS1和CsTPS2定位在1号染色体上，CsTPS3和CsTPS4定位在2号染色体上，CsTPS47和CsTPS48定位在14号染色体上，CsTPS40定位在11号染色体上，CsTPS41定位在12号染色体上，5个基因(CsTPS15、CsTPS36-CsTPS39)定位在10号染色体，5个基因(CsTPS42-CsTPS46)定位在13号染色体，有6个基因(CsTPS5-CsTPS10)定位在5号染色体上，10个基因(CsTPS11-CsTPS20)定位在7号染色体上，14个基因(CsTPS21-CsTPS34)定位在8号染色体上。其中，24个CsTPS基因分布在7号和8号染色体上。可以看出，CsTPS基因主要以串联重复的方式分布在染色体上。

　　3讨论与结论

　　不同植物的TPS基因家族数量存在显著差异，在被子植物中，TPS基因数量大约在40-152个[2]。前人通过转录组数据在舒茶早中共鉴定出23个具有完整编码序列的CsTPS基因[16]。而本研究在铁观音基因组中检索同时含有PF01397和PF03936且具有全长序列的基因，共鉴定出48个CsTPS基因，是舒茶早中CsTPS基因数目的2倍左右。另外，本研究对CsTPS基因进行了系统的生物信息学分析。系统发育分析表明，CsTPS基因家族可分为5个TPS亚家族，其中TPS-b是CsTPS家族中最大的亚家族，其次是TPS-a，这与舒茶早、拟南芥和番茄等研究结果相反[10,16,25]。

　　另外，前人没有对舒茶早进行染色体定位分析[16]，而本研究通过分析发现TPS基因不均匀地分布在10条染色体上，且以串联重复的形式出现，说明茶树TPS基因在进化过程中发生了基因复制扩增[25]。这与中粒咖啡和番茄的研究结果相似[13,25]。基因外显子-内含子结构在一定程度上反映了基因结构与功能的差异[24]。本研究中，相同亚家族的CsTPS基因外显子数量基本一致，与舒茶早、拟南芥及番茄TPS家族的基因结构分布相符[10,16,25]。已有研究表明，在舒茶早、农抗早和拟南芥中分别发现23、11和32个功能性TPS基因[10.16,26]。在本研究中，预测出32个功能性CsTPS基因，分别编码不同的萜类合成酶。

　　在舒茶早中，花或叶中大量表达的CsTPS基因被注释为倍半萜合酶基因[16]。这与本研究预测出的CsTPS基因功能相符，大部分为倍半萜合成酶。本研究中预测的TPS-g中5个CsTPS基因可能编码双功能芳樟醇/橙花醇合成酶和橙花叔醇合成酶，这与舒茶早、番茄、杨树中TPS-g中TPS基因已注释的功能相同[11,16,27]。

　　另外，本研究预测出2个CsTPS基因可能编码芳樟醇合成酶。有研究发现CsTPS基因杀青前表达量达到鲜叶的3.8倍，摇青后的做青叶具有典型的兰花香，推断该基因与乌龙茶香气品质的形成有关[8]。橙花叔醇、芳樟醇等具花果香的香气物质是乌龙茶香气的主要成分[4]。这暗示了铁观音加工成乌龙茶后香气馥郁持久可能与橙花叔醇、芳樟醇等化合物有关。

　　农艺师论文投稿刊物：《茶叶科学技术》(季刊)创刊于1960年，是福建省农业科学院茶叶研究所主办的茶叶科技综合性学术期刊。主要报道茶树栽培、茶树育种、茶园土壤肥料、茶叶机械、茶叶加工、茶树生理生化、茶树植保与茶叶经济等领域的新成果、新技术、新品种、新工艺与科学种茶、制茶经验、经营管理经验以及应用理论等。

　　在舒茶早中，CsTPS70被注释为贝壳杉烯合酶[16]。且拟南芥中的AtTPSGA1和AtTPSGA2分别编码柯巴基焦磷酸合酶和贝壳杉烯合酶，共同参与赤霉素的合成[10]。这暗示本研究中的CsTPS11和CsTPS40可能参与了茶树体内赤霉素的合成。已有研究证明拟南芥和杨树中TPS-f中的AtTPS4和PtTPS10被推测为二萜合成酶，能够将GGPP转化为香叶基芳樟醇[10,27]。本研究预测发现TPS-e/f中的CsTPS26、CsTPS31、CsTPS33可能编码香叶基芳樟醇合成酶。本研究预测的CsTPS基因是基于与已知功能的植物萜类合成酶同源基因序列的分析，具有较高的序列比对跨度和相似度[26]。但这些基因的化学功能仍需后续试验逐一验证。

　　参考文献[References]

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　　4张冬桃,孙君,叶乃兴,陈桂信.茶树萜烯类香气物质合成相关酶研究进展[J].茶叶学报,2015,56(2):68-79[ZhangDT,SunJ,YeNX,ChenGX.ResearchprogressofenzymesassociatedwithterpenesynthesisinCamelliasinensis[J].ActaTeaSin,2015,56(2):68-79]

　　作者：高婷郑玉成王鹏杰谷梦雅陈雪津洪雅萍侯炳豪叶乃兴