猴樟CbP5CS1基因克隆及表达载体构建

　　摘要为研究猴樟CbP5CS1蛋白的序列结构和功能，以猴樟转录组数据为基础，采用PCR技术克隆猴樟CbP5CS1基因CDS序列，构建表达载体。结果表明，克隆得到的序列具有一个2163bp完整的ORF框，编码720个氨基酸，与沉水樟中收录的RWR86140.1基因序列一致性达98.47%，GenBank登录号为MW813958;生物信息学分析结果表明，CbP5CS1蛋白化学分子式为34355609963105022，相对分子量77.91kD，理论等电点6.16，结构稳定，无明显无序化特征，为脂溶性和亲水性蛋白，磷酸化氨基酸位点有95个;CbP5CS1蛋白具有PLN02418家族结构域，具备δ吡咯啉羧酸合成酶的功能，在樟属植物中具有较高的保守性;CbP5CS1蛋白亚细胞定位预测为细胞质，为跨膜蛋白，但不存在信号肽;重组质粒用XbaI酶切后，获得两条带片段，与预期的2226bp和11516bp的大小一致，表明目的基因已经成功插入并连接到植物表达载体pCAMBIA1301上。

　　关键词猴樟;CbP5CS1;基因克隆;表达载体

　　猴樟CinnamomunbodinieriLevl.)为樟科樟属常绿乔木，主要分布于中国南方地区，是中国重要的精油加工树种、绿化树种和林用树种。近年来的研究表明，猴樟的生长速度和抗寒性优于香樟，猴樟比普通香樟具备更强的耐盐碱胁迫能力，碱胁迫下猴樟体内的脯氨酸明显高于普通香樟，脯氨酸在猴樟耐碱胁迫过程中起重要作用韩浩章等,2019)。植物体内的脯氨酸含量对环境变化敏感，在榉树韩浩章等2021)、银杏孙聪聪等2017)、白沙蒿王丽等2018)上的研究结果也表明，盐碱胁迫条件下植物体内的脯氨酸含量会大大提高，抗性强的树种中含有更高的脯氨酸含量。

　　外源施用脯氨酸能够促进植物光合能力和水分利用能力(Noreenetal.,2018;Waeletal.,2020)，还能通过诱导紫花苜蓿抗氧化酶活性提高抗盐碱胁迫能力邓凤飞等2016)。Igarashi等(1997)研究表明，盐胁迫下水稻抗盐品种的δ吡咯啉羧酸合成酶OsP5CS基因表达量和脯氨酸积累量均增加，而盐敏感品种中两者变化不明显。过量表达脯氨酸合成途径的关键酶P5CS会导致植物体内脯氨酸的积累(Mattiolietal.,2008)，研究P5CS蛋白理化特性，构建超表达载体，能为进一步研究脯氨酸在猴樟耐碱胁迫过程中的作用机理提供依据。

　　1结果与分析

　　1.1猴樟CbP5CS1基因的克隆以猴樟的cDNA为模板，通过PCR扩增得到一条约2000bp左右的条带，片段大小与预期一致，通过测序得到长2226bp的CDS序列。

　　PCR产物送公司测序，测序结果与沉水樟中收录的RWR86140.1基因进行比对，序列一致性高达98.47%，具备脯氨酸合成酶的活性。将克隆获得的基因编码蛋白通过NCBIBLASTProtein与数据库进行比对，根据比对结果显示，所克隆得到的序列具有一个2163bp完整的ORF框，推导编码720个氨基酸，将获得的目的基因命名为CbP5CS1，获得GenBank登录号为MW813958。

　　1.2猴樟

　　CbP5CS1蛋白的生物信息学分析

　　1.2.1猴樟

　　CbP5CS1蛋白的理化性质分析利用Protparam软件对猴樟CbP5CS1蛋白的理化性质进行分析，猴樟CbP5CS1蛋白相对分子量77.91kDa，理论等电点6.16，表明CbP5CS1基因编码蛋白为弱酸性，化学分子式为34355609963105022，原子总数为11079，不稳定指数值为29.24，不稳定系数大于40时为不稳定蛋白，因而该蛋白质是稳定的。CbP5CS1蛋白脂溶指数为106.83，脂肪族氨基酸比例(28%)高于芳香族氨基酸(5%)，为脂溶性蛋白，其中带负电荷的残基(asp+glu)总数为91，带正电荷的残基(arg+lys)总数为82。

　　CbP5CS1蛋白具有PLN02418家族结构域，具备P5CS的功能。利用ProtScale(web.expasy.org/protscale/)对猴樟CbP5CS1蛋白的亲水性进行分析图，得出总平均亲水性值(GRAVY)为0.008。通常认为，蛋白序列中氨基酸分值越低亲水性越强，分值越高疏水性越强，猴樟CbP5CS1氨基酸序列中第73位氨基酸分值最低为2.589，亲水性值最强;第411位氨基酸分值最高，为2.789，疏水性最强，亲水性氨基酸均匀分布在整个多肤链中，没有明显的疏水性区域，因此，推测猴樟CbP5CS1蛋白为亲水性蛋白。

　　1.2.2猴樟

　　CbP5CS1蛋白二、三级结构预测根据PRABI(npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl)在线软件预测结果图，该蛋白的组成为46.67%无规则卷曲、33.33%α螺旋和20.00%延伸链，因而猴樟CbP5CS1蛋白可能具备较复杂的功能，其稳定性主要依赖于氢键。利用FoldIndex预测猴樟CbP5CS1蛋白序列折叠无序化图，分析得出该蛋白无序化比例为2.5%，存在个氨基酸无序化结构域，这两个结构域可能具备特殊的功能。

　　利用NetPhos3.1预测猴樟CbP5CS1蛋白磷酸化位点图，分析得出该多肽链包含60个丝氨酸(S)、29个苏氨酸(T)和个酪氨酸(Y)磷酸化位点，该蛋白可能主要通过蛋白激酶发生磷酸化。利用SwissModel(www.Swissmodel.expasy.org)进行CbP5CS1蛋白三级结构预测分析，利用SwissModel同源建模图，经过比对CbP5CS1编码蛋白三级结构与PDB：6rtr.1.A的氨基酸序列一致性达61%，6rtr.1.A序列的编码蛋白为SemialdehydedehydrogenasePcd(半醛脱氢酶。

　　1.2.3猴樟

　　CbP5CS1蛋白亚细胞定位与跨膜结构预测利用CellPLoc2.0在线分析软件(www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/CellPLo2/)和LocTree3在线分析软件进行猴樟CbP5CS1蛋白的亚细胞定位预测，结果表明该蛋白定位于细胞质。利用TMpred(www.expasy.org/resources/tmpred)预测猴樟CbP5CS1蛋白跨膜结构图，分析得出该蛋白在93~113aa、248~264aa处各有一个从内到外的跨膜螺旋，其中心位点为105aa和256aa处。

　　在54~73aa、248~267aa、421~440aa处各有一个从外到内的跨膜螺旋，其中心位点为65、256、431aa处;其中248~264aa处从内到外的跨膜螺旋和248~267aa处从外到内的跨膜螺旋分值超过500，具有生物学意义，推测可能是跨膜蛋白。利用SignalP5.0Server(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽预测图，分析得出该蛋白Sec/SPⅠ型信号肽概率为0.084%，即猴樟CbP5CS1蛋白中极大可能不存在信号肽，不属于分泌蛋白。

　　1.3pCAMBIA1301

　　CbP5CS1表达载体构建及酶切验证将pCAMBIA1301空载体和含有CbP5CS1基因的载体质粒分别用NcoI和BglII双酶切，回收具有相同酶切位点的目的条带和载体，之后，将连接产物pCAMBIA1301CbP5CS1转化到DH5α感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆提取质粒后进行序列测定，测序比对正确的质粒用XbaI酶切该基因不含XbaI酶切位点，但在载体插入位置两端各有一个XbaI酶切位点，因此选择XbaI酶切验证载体中是否正确插入了目的基因，用XbaI酶切后，获得两条带片段，一条约2300bp，一条带约11000bp左右，与预期的2226bp和11516bp的大小一致图，酶切结果表明目的基因已经成功插入并连接到植物表达载体pCAMBIA1301上。

　　2讨论

　　脯氨酸不仅是植物体内重要的渗透调节物质，还与光合作用、呼吸作用密切相关，其合成场所为细胞质和叶绿体，分解场所为线粒体丁泽红等2016)。在渗透胁迫和氮素不足情况下，植物体内脯氨酸的合成以谷氨酸途径为主，P5CS是脯氨酸谷氨酸合成途径中的关键限速酶王红艳2016)，P5CS基因的表达特性对研究脯氨酸在植物响应逆境胁迫过程中的作用机理非常重要。Hu等(1992)首次从豇豆中克隆得到高等植物P5CS基因，该基因全长2417bp，包含单一开放阅读框，编码一个73.2kD多肽。

　　之后，研究者陆续从木薯付莉莉等2016)、拟南芥王翠平和华学军2017)、甜菜张皓等2019)、盐角草郝晓燕等2021)中克隆了P5CS基因，并对其耐盐特性及其编码的蛋白结构进行了分析，认为P5CS的蛋白结构在不同物种之间并不一致，但基本功能是一致的。本试验以猴樟cDNA为模版克隆的P5CS基因片段，具有一个2163bp完整的ORF框，编码720个氨基酸序列，与沉水樟P5CS蛋白序列同源性为98.47%。通过MEGA7.0软件构建CbP5CS1蛋白系统进化树的结果表明，猴樟CbP5CS1蛋白在进化上与同为樟科樟属的沉水樟聚为一类，说明其亲缘关系最近，樟科樟属植物中该类蛋白具有较高的保守性。

　　利用NCBI的CCD工具进行蛋白结构域预测结果表明，CbP5CS1蛋白具有PLN02418家族结构域，具备δ吡咯啉羧酸合成酶的功能。CbP5CS1蛋白相对分子量77.91kD，理论等电点6.16，化学分子式为34355609963105022，结构稳定、无明显无序化特征，为脂溶性、亲水性蛋白，与周利霞等(2019)结果一致。CbP5CS1蛋白多肽链中0.500以上分值的磷酸化氨基酸位点为95个，而磷酸化作用在植物信号转导、生长发育以及抗逆胁迫等方面发挥重要作用，说明P5CS的功能与逆境胁迫有关(Mogamietal.,2015)。

　　CbP5CS1蛋白的亚细胞定位预测为细胞质，很可能为跨膜蛋白，但信号肽预测分析得出该蛋白极大可能不存在信号肽，不属于分泌蛋白。本实验将获得的重组质粒用XbaI酶切后，获得两条带片段，一条约2300bp，一条带约12000bp左右，与预期的2226bp和11516bp的大小一致，酶切结果表明目的基因已经成功插入并连接到植物表达载体pCAMBIA1301上，为进一步通过转基因技术研究脯氨酸代谢在猴樟耐盐碱胁迫中的作用提供支持。

　　3材料与方法

　　3.1试验材料

　　试验材料为耐盐碱猴樟品系标注为HJHZ)3年生种苗，于2018年月上旬播种，2020年月上旬进行种苗表型鉴定与标记，同时移入盐碱土壤环境试验区进行栽培，株行距均为1.5。试验区土壤pH值8.17，电导率153μS/cm，可溶性盐含量15.89mg/g。于2020年月20日，取猴樟枝条顶部幼嫩叶片进行液氮速冻后，用RNAperpPurePlantKit(天根,北京试剂盒提取材料的总RNA，按照PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(TaKaRa,大连方法去除基因组DNA后，用TRPrimeMix(andomprimer)进行反转录反应，获得的cDNA产物作为模板。

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　　3.2基因克隆

　　根据猴樟转录组数据，获得具备P5CS蛋白功能的CDS序列，将其命名为CbP5CS1，使用PrimerPremier5.0软件设计扩增引物，PCR反应体系参照CloneUFOTMOneStepCloningKIT说明书，采用25μL体系：2×ProofastTMMasterMix12.5μL、10μmol上下游引物各1μL、模板0.6μL，用ddH补齐至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性180s;95℃变性10，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环;72℃延伸480s。PCR产物采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测分离，之后，使用DpnⅠ(2n/50μL扩增产物消化后进行重组反应，反应产物直接转化大肠杆菌Escherichiacoli)DH5α感受态细胞(TSINGKE,北京，挑单菌落进行PCR鉴定，将PCR阳性菌落培养后，提取质粒送擎科生物技术有限公司测序。

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　　作者：韩浩章张丽华李素华赵荣王芳王晓立蒋亚华